آلية التفاعل اللوني مسعور اختيار عمود للاستخدام في تنقية البروتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو اختيار عمود كروماتوغرافيا سائلة مثالي من نوع HI باستخدام طريقة استكشاف مؤتمتة لتنقية بروتين مأشوب باستخدام نظام BioRad DUO flow للكروماتوغرافيا السائلة ذات الضغط المتوسط. يتم تحقيق ذلك من خلال تحضير المحاليل المنظمة اللازمة والمحللات البكتيرية التي تحتوي على البروتين المأشوب المستهدف أولاً. بعد ذلك، يتم تركيب نظام duo flow للكروماتوغرافيا مادياً وتوصيل أنابيبه وتجهيزه لبروتوكول الاستكشاف.

ثم يتم تحميل العينات وتشغيل طريقة استكشاف عمود HI المبرمجة لجمع عينة الـ eit لكسور الفصل. وأخيراً، يتم تحليل الـ EIT وتحديد عمود HI والوسط الأمثل بناءً على خصائص الفصل الملحوظة. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح وسط عمود HI المفضل لتنقية البروتين المستهدف للباحث على نطاق واسع من خلال كروماتوغرافيا السوائل ذات الضغط المتوسط باستخدام قدرات استكشاف عمود HI المؤتمتة في نظام DUO flow.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل عمليات التشغيل المتتالية لكروماتوغرافيا العمود اليدوية، في أن أتمتة العملية تقلل من التباين وتضمن الحصول على نتائج عالية التكرارية. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة بعض الصعوبات بسبب التعقيد المادي لأنظمة الكروماتوغرافيا السائلة الحديثة، ومع ذلك، يمكن إتقان ذلك بسهولة.

بعد ممارسة كافية، ستقوم كل من أورانج ستون وشيلي أندرسون، وهما طالبتان من مختبري، باستعراض الإجراء. للبدء، قم بتحضير 500 milliliters من المحاليل المنظمة التالية: 200 millimolar من فوسفات الصوديوم للمحلول المنظم A one، و200 millimolar من هيدروجين فوسفات الصوديوم للمحلول المنظم A two، و4.8 molar من كبريتات الأمونيوم للمحلول المنظم B two، بينما يعمل الماء منزوع الأيونات كمحلول منظم B one. قم بإزالة الغازات من المحاليل المنظمة لضمان ظروف تشغيل كروماتوغرافية مثالية. سيقوم جهاز System Maximizer بخلط المحلولين A one وA two لإنتاج محلول شطف فوسفاتي منخفض الملوحة، كما سيقوم بخلط المحلولين B one وB two لإنتاج محلول كبريتات الأمونيوم عالي الملوحة.

محلول البدء. قم بتحضير 20 مللي لتر من العينة المراد تحميلها عن طريق خلط 10 مللي لتر من محلول تحلل الخلايا الذي يحتوي على البروتين المراد تنقيته مع 10 مللي لتر من المحلول المنظم B two. يجب أن يكون التركيز النهائي لكبريتات الأمونيوم في محلول عينة تحلل الخلايا حوالي 2.4 molar، مما يجعله مكافئاً تقريباً لمحلول البدء.

قم بترشيح خليط محلول التحلل باستخدام مرشح سرنجة بمسامية 0.45 ميكرومتر من النوع منخفض الارتباط بالبروتين لإزالة المواد الجسيمية من المحلول. احفظ العينة على الثلج حتى تصبح جاهزة للتحميل في النظام. ويعد الإعداد الفيزيائي والتوصيلات الهيدروليكية لنظام الكروماتوغرافيا أحد أكثر الجوانب تعقيداً في هذا الإجراء.

قم بإعداد نظام كروماتوغرافيا التدفق المزدوج (duo flow chromatography system) وفقًا للمخطط الموضح هنا. تأكد من توفر أحجام كافية من المحلول المنظم طوال البروتوكول وضمان بقاء الأنابيب مغمورة بشكل مستمر. قم بتوصيل صمام تحميل العينة وحلقة العينة الديناميكية كما هو موضح هنا، ثم صل حلقة العينة بمدخل صمام العينة في الموضع الثالث.

قم بتجهيز ثمانية أزواج متطابقة الحجم من أنابيب PEEK بقطر خارجي 1/16 بوصة. بعد ذلك، قم بتوصيل الأزواج بالمواقع من واحد إلى ثمانية في صمامات اختيار العمودين. بعد تشغيل مصابيح كاشف UV والتأكد من معايرة جميع الكواشف، قم بتركيب صمام تقسيم التدفق وجهاز التحكم في التقسيم الخاص بجامع الكسور كما هو موضح هنا.

يتم تشغيل صمام تقسيم مجمّع الكسور في الموضع الثاني ووحدة التحكم في التقسيم بشكل منفصل عن محطة عمل الكروماتوغرافيا. اضبط نسبة التقسيم على 10%. استبدل رأس التقطير القياسي لمجمّع الكسور في الموضع الثاني برأس تقطير مخصص للأطباق الدقيقة.

اشطف حلقة العينة وقم بتطهير نظام الكروماتوغرافيا. بعد ذلك، ابدأ تدفقاً يدوياً لمحلول التطور المنظم بمعدل 1 mL/min عبر النظام. صِل أعمدة HI trap بسعة 1 mL بالمواقع من 2 إلى 8 في صمامات اختيار الأعمدة.

قم بإزالة الوصلة التي تربط صمامات اختيار الأعمدة في الموضع الثاني. قم بتوصيل وصلات العمود الموجودة في المنبع بجهاز duo flow. مرر محلول الشطف المنقي عبر الوصلات حتى يتم طرد كل الهواء وتظهر قطرة كبيرة من محلول الشطف.

بعد ذلك، قم بإزالة السدادة المتصلة بمدخل العمود وضع قطرة كبيرة من محلول منظم منخفض الملوحة على الجزء العلوي من العمود. ثم قم بتوصيل العمود بالوصلات العلوية. قم بتوصيل المخرج بوصلات العمود السفلية وأنابيب صمام الاختيار.

اضبط حد الضغط العكسي على 40 PS.I واغسل العمود بخمسة أحجام من العمود من محلول الاستخلاص (Evolution buffer) بمعدل تدفق قدره 1 milliliter per minute. ثم اغسل العمود بـ 10 أحجام من العمود من محلول البدء (start buffer) بمعدل تدفق قدره 1 milliliter per minute.

بمجرد استقرار تتبع pH وUV والضغط العكسي، يتم تحويل صمامات اختيار العمود يدويًا إلى الموضع واحد وإيقاف تدفق المحلول المنظم. لتحميل العينة، يتم غمر أنبوب مدخل العينة في عينة بحجم 20 milliliter. بعد ذلك، يتم تحويل صمام غسيل تحميل حلقة العينة إلى الموضع واحد وصمام تحميل العينة إلى وضع التطهير (purge).

قم بتشغيل مضخة تحميل حلقة العينة، لسحب العينة إلى أنابيب المضخة بمعدل تدفق قدره 1 ml/min حتى تصل العينة مباشرة إلى صمام تحميل العينة. قم بتحويل صمام تحميل العينة من وضع التطهير (purge) إلى وضع التحميل (load). أعد تشغيل مضخة تحميل حلقة العينة بمعدل تدفق قدره 1 ml/min حتى يتم سحب 10 ml من العينة إلى حلقة العينة الديناميكية من نافذة الإعداد في برنامج biologic.

حدد أجهزة النظام المميزة بنجمة في هذا الجدول. بعد ذلك، اختر ستة أعمدة HIC لبرنامج التحليل. يبدأ تدرج ملحي خطي تنازلي وطريقة استكشاف بستة أعمدة تدفق المحلول المنظم المبدئي يدوياً بمعدل 1 mL/min.

اضغط على زر البدء (start) في وحدة تحكم الموزع لبدء تقسيم تدفق EIT بنسبة 90% إلى 10%، وفور بدء تشغيل طريقة البرنامج، اضغط على زر البدء في لوحة التحكم التي تظهر على الشاشة الخاصة بجامع الكسور لصفائح 96 بئراً غير المتصلة (offline). راقب شاشة العرض في الوقت الفعلي للتأكد من معلمات التشغيل المتوقعة. قارن تتبع الامتصاصية عند 397 نانومتر الخاص بـ GFP بتتبع الامتصاصية العام للبروتين عند 280 نانومتر لتقدير الفصل والتنقية النسبية باستخدام أوساط HI المختلفة التي يتم استكشافها. يمكن نقل أجزاء تتراوح من 5 إلى 50 µL من كسور صفيحة 96 بئراً إلى صفيحة جديدة واختبار محتوى البروتين النوعي بواسطة Eliza أو Western blot ومحتوى البروتين الكلي باستخدام SDS page أو نظام Experian للترحيل الكهربائي المائع الدقيق. تظهر هنا الموصلية لمتدرج ملح hick وضغط العمود النموذجي لعمليات الاستكشاف.

إن التغير في تركيز الملح، والمقاس بنسبة المنظم المسحوب من خطوط المنظم عالية الملوحة، هو أمر نموذجي في منهجية HI. ومع انخفاض تركيز الملح، تخرج البروتينات المرتبطة بالعمود وفقًا للموصلية، والتي تتوافق مع تركيز الملح الملحوظ، حيث يتم قياس تركيز الملح في الخط الذي يلي مباشرة كواشف quad tech وUV. ويشير الإزاحة بين تدرج الملح ومخططات الموصلية إلى الوقت المطلوب لانتقال المنظم من مدخل المنظم عبر النظام وصولاً إلى مراقب الموصلية.

يظل ضغط النظام ودرجة الـ pH ثابتين نسبيًا طوال فترة تشغيل العينة. يوضح هذا الشكل الكروماتوغرامات الخاصة بعمليات استكشاف متتالية لعمود HI مع الكشف المباشر عن إجمالي البروتين. يتم إنجاز NGFP من خلال قياس امتصاص الضوء عند 280 نانومتر و397 نانومتر على التوالي.

من الممكن تقريب الوفرة النسبية لبروتين GFP والفصل لكل عملية استكشاف. ومن خلال مقارنة الخطين في هذا الشكل، تم تصوير أنابيب استزراع الأجزاء 10 و12 و14 و16 و18 من عملية استكشاف الشمر FF تحت ضوء الغرفة المحيط أو الفلوري، كما عاينت أنابيب الأشعة فوق البنفسجية من الأمام ومن الأعلى لملاحظة طيف انبعاث GFP المميز، حيث تم الكشف عن GFP بوضوح في الجزء 14. وفي كلتا صورتي الأشعة فوق البنفسجية، يمثل اللون الأزرق المنتشر في اللوحة اليسرى للأشعة فوق البنفسجية الضوء المنبعث من مصباح الأشعة فوق البنفسجية.

تتوافق هذه البيانات التي تم الحصول عليها بعد التشغيل بشكل جيد مع الكشف المباشر عن GFP من خلال قياس امتصاص السائل المستخلص عند 397 نانومتر، وهو ما يحدد أيضاً أن الجزء 14 يحتوي على الذروة الرئيسية لـ GFP المستخلص. بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل لطخة ويسترن (western blotting)، ومقايسات ELISA، ومجهر القوة الذرية، ومقايسات إعادة التشكيل البيوكيميائية للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بنقاوة النشاط الوظيفي للبروتين الذي يتم تنقيته.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحاجة إلى التحكم اليدوي في نظام التدفق المزدوج في عدة نقاط من الطريقة. وتشمل الأمثلة على ذلك إعادة ملء المنظم (buffer)، وتحميل العينة، والتحقق من وجود فقاعات هوائية، وتشغيل وإيقاف مصابيح الكشف حسب الضرورة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام نظام الكروماتوغرافيا السائلة لإجراء استكشاف مؤتمت لأعمدة ووسائط HI المثلى.

سيتيح التحليل التقييمي الموضح في الرسم البياني والملصق للباحث اختيار العمود المناسب لعملية تنقية لاحقة على نطاق أوسع، والتي يمكن دمجها أيضاً مع طرق كروماتوغرافية أخرى لزيادة نقية البروتين المستهدف وإنتاجيته.