تنقية والتخيل من الأنفلونزا من المجمعات بروتين نووي ريبوزي الفيروسية

تبدأ هذه العملية بإزالة أي شوائب من محلول فيروس الإنفلونزا عن طريق الطرد المركزي. بعد ذلك، يتم تفكيك الغشاء الفيروسي باستخدام المنظف، ثم يتم فصل الـ VR nps المتحررة باستخدام تدرج الجلسرين.

يتم جمع كسور الطرد المركزي من التدرج، ثم يتم تشغيل جزء من كل كسر. وفي صفحة SDS-PAGE، تُصبغ الهلامات بصبغة Coomassie blue لتحديد الكسور الذروية التي تحتوي على V nps، ثم يتم تركيز الكسور التي تحتوي على V NPS عن طريق الطرد المركزي، وتُوضع VRPs المنقاة على شبكة عينة نحاسية لـ TEM، والتي تُصبغ بعد ذلك صبغاً سلبياً لتصوير VRPs بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ. مرحباً، أنا WinCo Wu من مختبر الدكتورة Nellie Pane في قسم علم الحيوان بجامعة كولومبيا البريطانية.

أنا ليندسي ويفر، من مختبر Pane سابقاً. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتنقية الإنفلونزا، وهي مركبات بروتينية نووية ريبوزومية فيروسية. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الاستيراد النووي لفيروس الإنفلونزا A في خلايا المزارع النسيجية.

دعونا نبدأ. لبدء التجربة، ضع 750 µL من منظم MNT في أنبوب طرد مركزي من البولي كربونات من شركة Beckman بحجم 11 ملم × 34 ملم. بعد ذلك، أضف 500 µL من محلول فيروس الإنفلونزا A بتركيز 2 mg/mL إلى الأنبوب، ثم قم بسحب السائل ودفعه بالماصة عدة مرات لخلط الفيروس مع منظم MNT.

بعد الخلط، ضع الأنبوب في جهاز دوران TLA one 20.2 وقم بإجراء عملية الطرد المركزي في جهاز Beckman Optima max E لمدة 10 دقائق عند 109,000 ×g وبدرجة حرارة 4 °C. عند انتهاء عملية الطرد المركزي، قم بإزالة الطافي، ثم أعد تعليق الراسب في 500 µL من محلول التفكيك المنظم (disruption buffer)، وقم برج الأنبوب بقوة باستخدام جهاز vortex. ثم قم برج الراسب المعاد تعليقه عند درجة حرارة 31 °C لمدة 20 دقيقة في جهاز einor thermo mixer.

عند الانتهاء من الرج، ابدأ بعملية طرد مركزي لسرعة الترسيب بتدرج الجلسرين. لتحضير تدرج الجلسرين، ضع الكميات التالية من الجلسرين في أنبوب طرد مركزي Beckman UltraClear مقاس 13 مليمتر في 51 مليمتر: 1 مليلتر من GLYCEROL بتركيز 70% حجم/حجم، و 0.75 مليلتر من جلسرين بتركيز 50%، و 0.375 مليلتر من جلسرين بتركيز 40%، و 1.8 مليلتر من جلسرين بتركيز 33%. يتم تحضير محاليل الجلسرين هذه عن طريق خلط الجلسرين النقي مع منظم NM.

قم أيضاً بتحضير أنبوب موازنة يحتوي على كل من الجلسرول والمحلول المنظم. بعد ذلك، قم برج عينة الفيروس الممزقة مرة أخرى باستخدام جهاز الرج (vortex) ثم قم بتحميلها على تدرج الجلسرول. ضع الأنبوب في جهاز طرد مركزي من نوع Beckman MLS 50 ذو دوّار ذو سلال متأرجحة، وقم بإجراء عملية الطرد المركزي للتدرج لمدة ثلاث ساعات و45 دقيقة عند 217, 000 ×g في درجة حرارة أربع درجات مئوية.

بعد اكتمال عملية الطرد المركزي، اجمع يدويًا أجزاءً مقسمة بحجم 250 µL من التدرج بدءًا من أعلى الأنبوب. احفظ الأجزاء على الثلج أو عند درجة حرارة 4 °C. وبمجرد جمع الأجزاء، نصبح مستعدين لتحليلها باستخدام الفصل الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد SDS.

لبدء تحليل SDS page، انقل 20 µL من كل جزء إلى أنبوب جديد. ثم أضف 5 µL من منظم عينات SDS page بتركيز 5x، وسخن العينة عند 95 °C لمدة خمس دقائق. بعد التسخين، قم بطرد العينات مركزياً لفترة وجيزة ثم حملها على هلام Poly acrylamide بتركيز 10%، مع وضع علامات الوزن الجزيئي في إحدى الآبار. بعد ذلك، قم بتشغيل العينات عبر الهلام حتى يصل صبغ التحميل brom phenol blue إلى منطقة قريبة من أسفل الهلام.

أخرج الهلام من جهاز SDS page وقم بصبغه بصبغة كوماسي الزرقاء. وبناءً على نتائج الصبغ، حدد الكسور التي تحتوي بشكل أساسي على البروتين النووي لفيروس الإنفلونزا.

يبلغ حجم بروتين NP الخاص بفيروس الإنفلونزا A حوالي 56 kilodaltons، وهو البروتين الرئيسي الموجود في معقدات البروتين النووي الريبوزي الفيروسي. لذا، عادةً ما يكون نطاق NP هو النطاق الأقوى في الأجزاء التي تحتوي على VRN ps. وفي الجزء التالي، سنقوم بتركيز أجزاء VRNP هذه.

اجمع كسور الجلسرول التي تحتوي أساساً على NP، ووزعها على أنبوبي طرد مركزي من البولي كربونات من شركة Beckman بمقاس 11 مليمتر × 34 مليمتر، ثم املأ كل أنبوب بماء فائق النقاء معالج بـ ethyl pyro carbonate أو DEPC. بعد ذلك، استخدم الماصة للسحب والدفع عدة مرات للمزج. ضع الأنابيب في دوار Beckman TLA 120.2 وقم بالطرد المركزي لمدة أربع ساعات ونصف بسرعة 157,000 ×g عند درجة حرارة 4 °C.

عند اكتمال عملية الطرد المركزي، قم بإزالة السائل الطافي وإعادة تعليق الراسب. في حصة قدرها 50 µL من الماء المعالج بـ DEPC، يتم وضع الـ V NPs المنقاة؛ خصص حصة واحدة جانباً وخزن الحصص الأخرى عند درجة حرارة -80 °C. الآن نحن مستعدون للمضي قدماً في عملية الصبغ السلبي لـ VRPs.

خفف 1 µL من VRNP المنقى في 9 µL من محلول PBS المنظم المُحضّر حديثاً والمفلتر مرتين، ثم قم بتفريغ توهجي لشبكة عينات TEM نحاسية لمدة 30 ثانية. كانت هذه الشبكة مغطاة مسبقاً بطبقة من Parlow Dion وفيلم كربوني. وباستخدام ملقط للإمساك بشبكة العينة التي خضعت للتفريغ التوهجي حديثاً، ضع قطرة بحجم 5 µL من VRNP المخفف على شبكة العينة.

اترك القطرة لتُمتص على الشبكة لمدة ثماني دقائق أثناء الانتظار. ضع شريطاً صغيراً من ورق الترشيح (parfum) في صينية، ثم ضع على ورق الترشيح قطرتين تحتوي كل منهما على 10 µL من محلول PBS المنظم، بالإضافة إلى قطرة بحجم 80 µL من محلول الصبغ المُحضّر حديثاً، والمكون من 1% ammonium melidate. الآن، اغسل شبكة العينة عن طريق خفضها بعناية في قطرتي PBS لمدة إجمالية قدرها دقيقة واحدة.

بعد ذلك، استخدم قطعة من ورق الترشيح لسحب جزء من محلول العينة من شبكة العينة دون السماح لها بالجفاف. وفور سحب آخر قطرة من المحلول المنظم من شبكة العينة، اغمر الشبكة بالكامل داخل قطرة الصبغة، وانتظر لمدة دقيقة واحدة.

بعد مرور دقيقة واحدة، استخدم قطعة جديدة من ورق الترشيح لامتصاص محلول الصبغة تماماً من شبكة العينة. اترك شبكة العينة لتجف في الهواء لعدة دقائق قبل الفحص. تظهر هنا صور ممثلة مأخوذة بواسطة مجهر إلكتروني نافذ لجسيمات V nps المصبوغة صبغة سلبية.

كما تلاحظون هنا، تشبه جسيمات V NPS الجسيمات العصوية ذات الأطوال المتغيرة التي تتراوح تقريباً بين 30 nanometers و120 nanometers في الطول. والجسيم النانوي الأوليغومري منظم كسلسلة من جزيئات NP التي تنطوي بدورها لتشكل بنية تكرارية لولبية مزدوجة. لذا، يمكن أحياناً رؤية عروات عند كلا الطرفين من هذه الجسيمات عصوية الشكل.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية تنقية وتصور المعقدات البروتينية النووية الريبوزومية الفيروسية (viral ribonucleoprotein complexes) الخاصة بإنفلونزا. عند إجراء هذا البروتوكول، من المهم عدم استخدام PBS عند تخفيف VRNPs إذا كنت تستخدم خلات اليورانيوم في التلوين السلبي.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.