Bromodeoxyuridine (BrdU) التوسيم والفرز وبعد الإسفار خلية المنشط للتحديد ، ثقافة مستقلة عن العضوية الذائبة الكربون المهينة العوالق البكتيرية

تتوسط الميكروبات عملية تحلل العديد من ركائز الكربون العضوي المذاب أو مركبات DOC، كما هو الحال في البيئات المائية. ولفهم دور الميكروبات في تحويل DOC بشكل كامل، من الضروري تحديد تصنيفها ووظيفتها في آن واحد. يستعرض هذا الفيديو إجراءً للتحديد التصنيفي للبكتيريا حرة المعيشة أو العوالق البكتيرية التي تعمل على تحويل أحواض محددة من DOC في البيئات المائية.

تتم معالجة عينات المياه التي تم جمعها من بيئة اختبار وتحضينها مع المركب محل الدراسة وبرومو ديوكسي يوريدين، BRDU، الذي يندمج في الحمض النووي DNA المصنع حديثاً وفي الخلايا التي تنمو بنشاط. بعد ذلك، يتم وسم العوالق البكتيرونية المـوسومة بـ BRDU باستخدام أجسام مضادة لـ BRDU مقترنة بـ ZI. ثم يتم عزل العوالق البكتيرونية ذات المستويات العالية من وسم BRDU عن طريق فرز الخلايا المنشط فلورياً.

يتم بعد ذلك استخلاص الـ DNA من الخلايا التي تم فرزها، ويُجرى التحديد التصنيفي بناءً على نتائج تحليل جين 16 s ribosomal RNA باستخدام تقنية PCR. مرحباً، اسمي ستيفن روبنز من مختبر الدكتور Chen Mao في قسم العلوم البيولوجية بجامعة Kent State. سأقوم أنا وزميلي اليوم بعرض طريقة مستقلة عن المزارع المخبرية لتحديد العوالق البكتيرية المفككة لـ DOC في البيئات المائية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل التعديلات الغذائية المتبوعة بتحليل الحمض النووي للمجتمعات البكتيرية، في أنها تركز التحليل على البكتيريا عالية النشاط وتستبعد الخلايا الخاملة وبطيئة النمو. نوضح هنا كيفية تحديد العوالق البكتيرية التي تستخدم مركباً واحداً محدداً من الكربون العضوي المذاب (DOC). ولكن يمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً لدراسة العوالق البكتيرية التي تستخدم مركباً واحداً آخر من الـ DOC أو مجموعة من الـ DLCs مثل الإفرازات الطحلبية.

لذا، دعونا نأخذ بعض عينات المياه ونبدأ. قبل إجراء تحليل عينات المياه للبحث عن العوالق البكتيرية التي تحلل الكربون العضوي المذاب (DOC)، يجب معالجة عينات المياه بشكل مناسب. تم جمع العينات الموضحة هنا من ساحل جورجيا لإزالة الجسيمات الكبيرة والمواد العالقة من عينة المياه.

استخدم مضخة تمعجية لنقل الماء من قارورة التجميع إلى وحدة ترشيح تحتوي على مرشح بحجم مسام 1 µm. بعد ذلك، انقل حصصاً بمقدار 36 mL من الراشح إلى ثلاثة أنابيب بولي بروبيلين معقمة سعة 50 mL، بحيث يحتوي كل أنبوب على 4 mL من محلول Paraformaldehyde بتركيز 10% مُحضَّر حديثاً. تُحضن العينات لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة لحفظ الخلايا بعد عملية التحضين.

اسكب الماء في برج الترشيح الخاص بوحدة ترشيح فراغية زجاجية تحتوي على مرشحات غشائية بيضاء بمسامية 0.22 micrometer، ثم قم بتطبيق الفراغ لسحب المحلول عبرها. اغسل المرشح بتمرير 10 milliliters من PBS عبر مرشح الفراغ. ضع ملصقات على المرشحات كضوابط سلبية واحفظها عند درجة حرارة minus 20 degrees Celsius.

لإنشاء نظام بيئي تجريبي أو عالم مصغر، ابدأ بملء ست دوارق زجاجية سعة لتر واحد، مغسولة مسبقاً، بـ 800 milliliters من عينة المياه المرشحة مسبقاً. أضف BRDU إلى كل عالم مصغر ليصل إلى تركيز نهائي قدره 10 micromolar. قم بتدوير الدوارق بسرعة يدوياً للمزج.

سيتم تحليل كل عينة في ثلاث مكررات. لذا، أضف مركب DOC النموذجي إلى ثلاثة من النماذج البيئية المصغرة. هنا، تضاف مادة reine إلى النماذج البيئية المصغرة بتركيز نهائي قدره 100 nanomolar.

بعد ذلك، أضف محلول PBS المعقم إلى النماذج المصغرة الثلاثة الأخرى؛ حيث ستعمل هذه النماذج كعناصر تحكم خالية من DOC. ضع جميع النماذج المصغرة في حاضنة هزازة بسرعة 100 RPM في الظلام وبدرجة حرارة الموقع، وهي 25 °C. يتم أخذ العينات هنا عند النقاط الزمنية 0 و8 و16 و24 ساعة.

اجمع 36 ملليلتر من كل نموذج مصغر في أنبوب بولي بروبيلين معقم سعة 50 ملليلتر يحتوي على أربعة ملليلتر من بارافورمالدهيد 10% طازج، ثم حضن العينات لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة لتثبيت الخلايا. بعد ذلك، قم بترشيح الخلايا المحفوظة عبر مرشحات غشائية بيضاء بحجم مسام 0.22 ميكرومتر. مرر 10 ملليلتر من PBS عبر مرشح التفريغ لغسل بقايا PFA.

انتقل فوراً إلى الكشف المناعي الموضعي لـ INS أو قم بتخزين المرشحات عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لتقدير دمج BRDU في العوالق البكتيرية. ابدأ بتدفئة مرشحات العينات في درجة حرارة الغرفة لإضعاف الجدار الخلوي البكتيري. ضع المرشح على وحدة ترشيح، ثم انقل 1 مل من محلول الليزوزيم بالماصة فوق المرشح لتغطية الخلايا، واحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

بعد انتهاء فترة الحضن، قم بتطبيق تفريغ هوائي لإزالة المحلول. وبمجرد مرور المحلول عبر المرشح، اغسل الخلايا بإضافة 10 milliliters من PBS مع تطبيق تفريغ هوائي. بعد ذلك، ولزيادة تكسير الجدار الخلوي، أضف one milliliter من محلول proteinase K إلى المرشح لتغطية الخلايا.

يُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. يُغسل بمحلول PBS للحصول على طبقات مفردة من DNA. يُضاف 1 mL من محلول exonuclease لتغطية الخلايا الموجودة على المرشح.

يُحضن عند 37 °C لمدة 30 دقيقة. وبعد انتهاء فترة التحضين، يُغسل المرشح بتمرير 10 mL من PBS عبر مرشح الفراغ. بعد ذلك، تُقص حواف المرشح لإزالة الجزء الذي لا يحتوي على خلايا.

بعد ذلك، وعلى سطح جاف ومنظف بالكحول، استخدم شفرة معقمة لتقطيع المرشح إلى ثماني قطع متساوية الحجم. يلزم توفير ثماني غرف تحضين ذات سدادات إطارية لكل عينة؛ ضع ثُمن المرشح في غرفة التحضين المجمعة بحيث يكون جانب العينة متجهًا للأعلى. وبمجرد تجميع الغرف، استخدم مجموعة Roche Intu cell proliferation kit للكشف عن الخلايا المحددة بـ A-B-R-D-U في موضعها الأصلي.

بمجرد اكتمال الإجراءات الثابتة، قم بإزالة قسم المرشح من غرفة الحضن ووضعه على سطح معقم، ثم استخدم شفرة معقمة لتقطيع قسم المرشح إلى قطع صغيرة. انقل قطع المرشح إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 ml يحتوي على 1 ml من محلول PBS، ثم أغلق الأنبوب بإحكام وأحكم إغلاقه باستخدام البارافيلم. بعد ذلك، قم بحضن الأنبوب في حاضنة هزازة عند درجة حرارة 37 °C وسرعة 200 RPM لمدة 10 دقائق.

بعد انتهاء فترة التحضين، أحكم إغلاق الأنبوب وقم بمزجه بجهاز الفورتيكس (vortex) بأقصى سرعة. ولمدة خمس دقائق، انقل السائل الطافي (SUP natant) باستخدام الماصة إلى أنبوب بولي بروبيلين معقم سعة 15 milliliter. بعد ذلك، أعد تعليق المرشح في محلول PBS وكرر خطوتي المزج بالـ vortex والتحضين مرتين إضافيتين، مع إضافة السائل الطافي (snat) في كل مرة إلى نفس الأنبوب سعة 15 milliliter لكل عينة.

تُخزن الخلايا المعاد تعليقها عند درجة حرارة 4 °C. ويجب تحليل العينة بواسطة الفاكس خلال يومين. وأخيراً، يتم فرز الخلايا للحصول على المجتمع الخلوي الذي يتميز بمستوى عالٍ من دمج BRDU.

في هذه التجربة، يتم استخدام جهاز قياس التدفق الخلوي BD FACS Area والبرمجيات المتوافقة معه. وبمجرد فرز الخلايا، يمكن تحليل المجموعة المخصبة بـ BRDU لتحديد هويتها التصنيفية. ولتضخيم جينات 16s rRNA للبكتيريا التي تم فرزها باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، يتم نقل الخلايا المفرزة بواسطة الماصة إلى مرشح غشائي من البوليكربونيت ذو مسام بحجم 0.22 µm، ثم يتم تشغيل مضخة التفريغ، وبعد ذلك تُستخدم شفرة معقمة لقص الحواف الخالية من الخلايا من المرشح.

قطّع المرشح إلى أربع قطع متساوية الحجم لكل حالة، وضع قطعة مرشح واحدة في كل أنبوب من أنابيب تفاعل PCR الثلاثة، بحيث تكون الخلايا مواجهة للداخل. أضف 45 µL من الماء المخصص لتفاعلات PCR. اترك قسم المرشح ينغمر تماماً في الماء.

بعد ذلك، أضف خرزتين من Roche illustra pure T ready to go PCR مع رجها سريعاً باستخدام جهاز vortex للمساعدة في إذابة الخرز. ثم أضف ميكرولترين من كل من البادئات الأمامية والعكسية لجين 16 s ribosomal RNA.

أضف إما 1 µL من BSA للمساعدة في امتصاص مثبطات التضخيم أو 1 µL من الماء. قم بإجراء تضخيم PCR باستخدام جهاز التدوير الحراري. يُوصى باستخدام برنامج touchdown PCR، حيث تنخفض درجة حرارة التلدين بالتتابع من 62 إلى 52 °C بمقدار درجة واحدة مئوية لكل دورة، تليها 15 دورة عند 52 °C.

تأكيد تضخيم PCR عن طريق الرحلان الكهربائي على هلام Agros بتركيز 1% مصبوغ ببروميد السيزيوم، ثم استئصال نواتج تضخيم PCR من الهلام وتنقيته باستخدام طقم KaiGen cayo quick gel extraction. بعد تنقية هلام PCR، يتم تجميع نواتج التضخيم الخاصة بنفس العينة معاً. وبذلك تصبح نواتج تضخيم 16 s ribosomal DNA المنقاة جاهزة لسلسلة من التحليلات الجزيئية.

تم جمع العينات من موقع ساحلي في ولاية جورجيا ومعالجتها لدراسة البكتيريا التي تحلل مادة Racine وفقاً للإجراءات الموضحة في هذا الفيديو. تعد Racine مركباً متعدد الأمين يمكن العثور عليه على نطاق واسع في البيئات البحرية، ويمكن أن تعمل كمصدر للمغذيات والطاقة للبكتيريا البحرية كما هو موضح هنا.

كشف تحليل حقائق العينات أنه بعد تحضين لمدة 24 ساعة، ظهرت مجموعة من البكتيريا ذات مستوى أعلى من كثافة فلورة FXI، والتي كانت مرتبطة إيجابياً بمدى دمج BRDU، وذلك في النماذج المصغرة المعدلة بـ Racine. وقد صُنفت هذه الخلايا على أنها خلايا ذات دمج عالٍ لـ BRDU أو HI، وكان من المتوقع أن تحتوي في الغالب على بكتيريا محللة لـ Racine. لا توجد خلايا hi.

وُجدت الخلايا في عينات التحكم التي لم يُضف إليها شيء، والتي احتوت فقط على خلايا ذات مستويات أقل من دمج BRDU والتي أُشير إليها باسم الخلايا lii، وكان من المتوقع أن تحتوي بشكل أساسي على بلانكتون بكتيري غير قادر على الاستخدام. تم فرز خلايا Racine HI المضافة في أنابيب منفصلة ثم جُمعت على مرشحات غشائية. تم الحصول على مضاعفات جينية جزئية لجين 16 ribosomal RNA بعد إجراء PCR للمرشح وتم التأكد منها بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام.

بعد عملية الترشيح بالفرز، يمكن أيضًا إجراء تضخيم بتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للجينات الوظيفية لفحص التنوع الوظيفي بين الخلايا المفروزة. لقد عرضنا لكم للتو كيفية فصل وتحديد الخلايا البكتيرية الوظيفية ماديًا في البيئة المائية باستخدام نهج يربط بين فرز الخلايا المنشط فلوريًا ودمج BRDU. تذكر أن BRDU مادة سامة، لذا يجب دائمًا ارتداء معطف المختبر والقفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.