ReAsH / فلاش الوسم وتحليل صورة البروتينات في خلايا الاستشعار Tetracysteine

الهدف العام من هذا الإجراء هو وسم الخلايا التي تعبر عن بروتين يحمل وسم الفلوريسنت ورباعي السيستين باستخدام صبغات flash أو ash، وتحليل النتائج كمياً. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق ترانسفكشن بلازميد يحمل بروتيناً فلوريسنت والبروتين المستهدف الذي يحتوي على وسم رباعي السيستين في خط الخلايا المطلوب. بعد ذلك، يتم وسم البروتين المُعبر عنه باستخدام R أو flash، ثم تُزال الصبغة المرتبطة بشكل غير محدد عن طريق الغسل باستخدام BAL للتحضير للتصوير المجهري.

بعد ذلك، يُستخدم مجهر بؤري (confocal microscope) لجمع صور فلورية للخلايا باستخدام قنوات ash أو flash وقنوات البروتين الفلوري. وفي النهاية، تُحلل الصور باستخدام برنامج Image J لقياس كمية ارتباط ash أو flash بالبروتين المستهدف. وفي الختام، يمكن الحصول على نتائج توضح مدى ارتباط ash أو flash بالبروتين المستهدف في الخلايا من خلال إيجاد الارتباط بين فلورية ash وفلورية البروتين الفلوري.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل مجرد دمج البروتين المستهدف مع GFP، في القدرة على تتبع خاصية ثانية للبروتين، مثل التغير التشكيلي بالإضافة إلى تحديد موقعه. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال البنية الفرعية للبروتين ووظيفته، مثل أحداث التشكيل، والتغيرات التشكيلية، وأحداث ارتباط LI التي تغير قدرة TAC على الوميض أو التوهج. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أردنا تقييم كيفية تشكل تجمعات متعدده صغيرة دون مجهرية من بروتين met Huntington داخل الخلايا.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات تحليل البيانات يصعب تعلمها نظراً لتعقيدها التقني. سيقوم كل من ياسمين رانسون، المساعدة البحثية في مختبرنا، بتوضيح الإجراءات التجريبية في الخطوات من الأولى إلى الثالثة، بينما سيقوم سيفكي غان، طالب الدراسات العليا في مختبرنا، بتوضيح تحليل البيانات في الخطوة الرابعة. استخدم طرق زراعة الخلايا القياسية لخط الخلايا المستهدف وشريحة تصوير للخلايا الحية جاهزة للترانسفكشن.

قم بتحضير مزرعة من الخلايا الملتصقة ثم قم بنقل البلازميد الذي يحتوي على جين وسم TC المستهدف. ووفقاً لطريقة النقل المختارة، من المهم توفير ضوابط إيجابية وسلبية لتقييم مدى الارتباط النوعي بوسوم TC، وكذلك لتقييم تدفق التبييض أو التداخل الفلوري بين القنوات عند جمع الصور المجهرية البؤرية. لذا، في حالة استخدام لونين، تأكد من تحضير عينات لألوان مفردة، إما البروتين الفلوري بمفرده، وإذا أمكن، بروتين T ctech مرتبط بـ flesh أو ما شابه.

ولكن بدون بروتين فلوري. بعد يوم أو يومين من عملية عفن الخلايا (transfection)، اشطف الخلايا برفق باستخدام 300 microliters من محلول هانكس الملح المتوازن (HBSS) المسخن مسبقاً، وقم بتحضير محلول HBSS طازج ومسخن مسبقاً يحتوي على 10 micromolar من 1,2-ethanedithiol أو EDT و 1 micromolar من ash. وبعد إزالة محلول HBSS من الخلايا، استبدله برفق بـ 300 microliters من وسط ash، ثم قم بالتحضين لمدة 30 دقيقة بالضبط عند 37 degrees Celsius في حاضنة زراعة الأنسجة.

من خلال خبرتنا، تؤدي فترات الحضن الأطول إلى زيادة كبيرة في الفلورة الخلفية. اسحب محلول الوسم بلطف من الخلايا واستبدله بـ 300 µL من HBSS الدافئ مسبقاً المحتوي على 250 µM من two three dimer، cap propanol، أو BAL لمدة 15 دقيقة عند 37 °C. أزل محلول الغسيل عن طريق السحب اللطيف واستبدله بـ 300 µL من HBSS الدافئ مسبقاً.

بعد هذه الغسلة، يمكن تثبيت الخلايا باستخدام البارافورمالدهيد، على الرغم من أننا وجدنا أن هذا يزيد من الفلورة غير النوعية. لذا، نقوم عادةً بتصوير الخلايا وهي حية في درجة حرارة الغرفة. بالإضافة إلى ذلك، فإن تثبيت الخلايا قبل الوسم يمنع ارتباط صبغة bial.

لبدء تصوير الخلايا باستخدام المجهر البؤري (confocal microscope)، قم بضبط معايير تصوير الفلوروفورات الفردية وتأكد من عدم وجود تداخل ضوئي (bleed through) يُذكر بين القنوات. بعد ذلك، اضبط إعدادات مضاعف الضوء الكهروضوئي بحيث لا يؤدي الحد الأقصى من الفلورة في العينة إلى إشباع الكاشف. وبمجرد تحديد أفضل إعدادات التصوير، لا تقم بتغيير أي منها بين العينات المختلفة.

استخدم معدل مسح قدره 200 hertz، وقم بجمع أربعة متوسطات للخطوط، واضبط قطر الثقب الضيق (pinhole) على وحدة مساحة واحدة. يمكن توسيع قطر الثقب الضيق إذا كانت نسبة الإشارة إلى الضوضاء تشكل مشكلة، ومع ذلك، قد يؤدي ذلك إلى بعض الفقدان في دقة التصوير.

قم بجمع الصور المجهرية البؤرية (confocal images) بتنسيق 12 بت أو أعلى إذا كان ذلك ممكنًا، وذلك لرفع جودة تحليل البيانات الكمية إلى أقصى حد. قم بجمع الصور لقناة البروتين الفلوري وأيضًا لقناة صبغة BI arsenal لجميع العينات.

لتحليل البيانات، استخدم برنامج Image J مع المكونات الإضافية التالية. في حال استخدام إصدار من Image J أقدم من الإصدار 1.32 C، انقر فوق الخيارات التالية. لتمكين فتح صور متعددة في وقت واحد، انتقل إلى تحرير خيارات الإدخال/الإخراج، ثم حدد المربع الخاص باستخدام j file chooser للفتح/المشاركة.

انقر موافق. افتح الصور المطلوبة. سيقوم برنامج Image J تلقائيًا بتحديد الحدين الأقصى والأدنى لكثافة البكسل المعروضة على الشاشة لكل صورة على حدة، نظرًا لأن الصور المختلفة ستكون ذات كثافات بكسل مختلفة.

هذا يعني أن الصور المعروضة غير قابلة للمقارنة كما تظهر حالياً. ولضمان أن تكون جميع الصور المفتوحة على نفس المقياس، قم بتحديد شدة البكسل العليا والسفلى المراد عرضها فعلياً. ولضبط هذه القيم، اختر "صورة" (image)، ثم "ضبط السطوع/التباين" (adjust brightness/contrast).

انقر على "set"، ثم حدد القيم الدنيا والقصوى للعرض. بعد ذلك، اختر "propagate to all open images" وانقر على "okay". بدلاً من ذلك، يمكن وضع جميع الصور الخاصة بقناة معينة معاً في ملف واحد أو مكدس (stack).

بعد ذلك، سيقوم برنامج Image J بضبط جميع الصور تلقائيًا على نفس المقياس. وللقيام بذلك، اختر image stacks ثم images to stack، وأدخل اسمًا مشتركًا لكل ملف، واختر used titles as labels. ثم انقر فوق okay.

قم بتحويل جميع الصور المفتوحة إلى نظام 8-bit لإجراء التحليل. من خلال اختيار نوع الصورة 8-bit، سيتم إعادة تحجيم النطاق المعروض إلى فاصل يتراوح من 0 إلى 255. من المهم عدم الحفظ فوق التنسيق الأصلي 12-bit أو التنسيقات الأعلى، لأن ذلك سيؤدي إلى فقدان محتوى المعلومات.

احفظ نسخة في مجلد جديد باسم eight bit converted باستخدام خيار "حفظ باسم". إحدى الطرق لفحص مدى ارتباط صبغة bi arsal في صورة كاملة هي إجراء مخطط ارتباط كثافة البكسل. يقوم هذا المخطط برسم قيمة كل بكسل في قناة واحدة بالنسبة لقيمة البكسل المقابلة في قناة ثانية.

وبناءً على ذلك، فإن موضع البكسل الذي يُظهر فلورة GFP عالية سيكون أيضاً مرتفعاً في فلورة الرماد في حال وجود ارتباط عالٍ. ولتحليل الارتباط المشترك للبكسلات، تأكد من فتح صورتي REA وGFP بدقة 8-بت في برنامج image J. بعد ذلك، افتح ملحق image correlator عن طريق اختيار plugins ثم image correlator. قم بتعيين ملفات الصور إلى image one وimage two.

ثم انقر فوق موافق. قد لا تعرض الحزمة الناتجة أي معلومات مفصلة، وهذا أمر طبيعي.

احفظ المجموعة في مجلد جديد يسمى scatterplots وامنحها نفس اسم الملف الخاص بالعينة التي تشير إليها. على سبيل المثال، Ash GFP Correlation plot. لعرض البيانات، اختر أحد الخيارين.

أولاً، قم بتحويل البيانات بحيث تصبح بتنسيق لوغاريتمي عن طريق اختيار process math log auto. ثم لإعادة تحجيم البيانات بصرياً، انقر فوق image adjust brightness slash contrast واختر auto. ثانياً، أعد تحجيم البيانات بصرياً لإظهار القيم المنخفضة فقط، واعرض البيانات باستخدام جدول بحث خاص أو LUT لإنشاء LUT مخصص.

انقر فوق "تحرير ألوان الصورة" (image color edit LUT) للحصول على جدول بحث (LUT) بسيط للغاية. انقر فوق البكسل الموجود في أعلى اليسار واختر اللون الأسود. ثم اختر البكسل التالي إلى اليمين واختر اللون الأحمر.

بعد ذلك، انقر فوق البكسل الثالث، ومع الاستمرار في الضغط على زر الماوس، اسحب التحديد إلى البكسل الموجود في أسفل اليمين. اختر اللون الأحمر، ثم انقر موافق، وبعد ذلك اختر اللون الأبيض وانقر موافق. اختر نطاق السطوع/التباين من 0 إلى 255 كما هو موضح سابقاً لتثبيت الصورة كما تظهر على الشاشة.

قم بتحويلها إلى تنسيق RGB لنسخ الصور ولصقها في برامج أخرى. أولاً، افتح الصور ذات الـ 8 بت أو 16 بت كما هو موضح سابقاً. قم بتعيين مخطط ألوان LUT للصور الخاصة بـ GFP.

قم بتعيين جدول البحث (LUT) الأخضر من خلال النقر على الصورة. جداول البحث الخضراء. وأخيرًا، حدد الصورة المراد نسخها وقم بنسخها إلى الحافظة عبر اختيار تحرير ثم نسخ إلى النظام؛ يوضح هذا الشكل نتيجة نموذجية لبروتين الكيناز sock المدمج، وGFP، وعلامة TC التي تم صبغها لمدة 30 دقيقة.

مع وجود ash في خلايا HEC 2 9 3، يبدو أن ASH يرتبط بكفاءة وبالألفة العالية بالبروتين المستهدف الذي يحمل علامة TC. وفي المقابل، يوضح هذا الشكل عينة الضبط المقابلة لـ SARK المدمج مع GFP، ولكن بدون علامة TC، وهو أمر ضروري للتحقق من خصوصية علامة TC ومستوى التلوين الخلفي. وتظهر هذه النتيجة أن RH لا يمتلك أي تفاعلية مع البروتين المستهدف الذي يفتقر إلى علامة TC، مما يشير إلى خصوصية علامة TC لارتباط SSH.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر عدم السماح للخلايا بأن تصبح متلاصقة (confluent) وهادئة، لأن ذلك سيؤثر على ارتباط V في الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل بياناتك كمياً ببساطة، ويمكنك تحسين هذه الطرق لتطوير نظام IUTS الخاص بك لتمثيل البيانات بصرياً.