الروبوتات والتحليل الديناميكي صورة للدراسات في التعبير الجيني في أنسجة النبات

في هذا الإجراء، يتم تصوير ديناميكيات التعبير الجيني في أنسجة النبات بمرور الوقت باستخدام الروبوتات؛ حيث يتم أولاً تعقيم بذور الفاصوليا العريضة ووضعها بين مناشف ورقية رطبة في وعاء زراعة أنسجة من أجل الإنبات. وبعد مرور أربعة أيام، يتم إزالة الفلقات وقذفها بتركيب DNA يحتوي على محفز مدمج مع GFP. ثم توضع الفلقات في أطباق بتري وتثبت على نظام روبوتي مخصص لجمع الصور ثنائي الأبعاد. وقد تمت برمجة الروبوت لالتقاط صور لكل قطعة نسيج كل ساعة لمدة 100 ساعة.

تخضع الصور لتحليل الصور، مما يوفر بيانات كمية حول شدة تعبير GFP بمرور الوقت. مرحباً، أنا جون فاينر، مدير مختبر التحول النباتي في قسم البستنة وعلوم المحاصيل بجامعة ولاية أوهايو. أنا كارلوس هيرنانديز غارسيا، طالب دكتوراه في المختبر النهائي بجامعة ولاية أوهايو.

سيقوم كارلوس اليوم بعرض البروتوكول الذي طورناه لتحليل التعبير الجيني في أنسجة النبات باستخدام البروتين الفلوري الأخضر. نحن نستخدم هذا الإجراء الذي طورناه في المختبر لقياس إجهاد نشاط OD. ولتحقيق ذلك، نقوم بدمج المحفز الخاص بنا في المنطقة العلوية (upstream) من جين GFP، والذي يمثل الجين المراسل لدينا.

سأوضح لكم كيفية إدخال التحكم في المحفز في أوراق نبات الفاصوليا (Lima bean) وتصويرها باستخدام نظام التقاط الصور الروبوتي المصمم خصيصاً لدينا. وسأختتم بذلك بمراجعة البروتوكول الخاص بنا لتحليل الصور. لذا، لنبدأ؛ في بداية هذا الإجراء، يتم تعقيم سطح بذور الفاصوليا باستخدام الإجراءات القياسية.

ضع البذور المعقمة في سبع حاويات magenta بين طبقات من المناشف الورقية المبللة، ثم قم بتحضينها لمدة أربعة أيام عند 25 درجة مئوية. نستخدم هنا ناقل تعبير ذو عدد نسخ مرتفع، وهو مفيد لتحليلات المحفز وعناصر المحفز. يحتوي هذا الناقل على جين GFP، الذي يُستخدم لتصور وظيفة المحفز أو عناصر المحفز في الأنسجة المحولة قبل ساعة إلى ساعتين من عملية القذف الجزيئي.

استأصل أجنة حبوب الليما (CU leadin) من غلاف البذور. يجب أن تكون أجنة CU leadin المناسبة للقصف الجيني ذات لون أصفر إلى أخضر فاتح، ومسطحة، وخالية من أي تلف قد يتداخل مع تحليل الصور اللاحق؛ فمباشرة بعد الاستئصال، ضع 12 جنين CU leadin في طبق بتري يحتوي على وسط زراعة OMS المكون من أملاح MS، وفيتامينات B الخمسة، و3% sucrose و0.2% gel rate عند pH 5.7. بعد ذلك، قم بترسيب بنية DNA على جزيئات التنجستن M 10؛ أولاً، وقبل الاستخدام مباشرة، أعد تعليق الجزيئات في ماء معقم لتصل إلى تركيز 100 milligrams per milliliter.

بعد ذلك، في أنبوب طرد مركزي سعة 0.6 milliliter، أضف 25 µL من الجسيمات، و5 µL من DNA بتركيز 1 µg/µL، و25 µL من كلوريد الكالسيوم بتركيز 2.5 M، و10 µL من spermine بتركيز 100 mM. يتم تحضين تحضيرة DNA على الثلج لمدة خمس دقائق، ثم تُزال وتُتخلص من 50 µL من المحلول الموجود فوق الجسيمات. أعد تعليق الجسيمات المغلفة بـ DNA المتبقية في قاع الأنبوب عن طريق الرج بمجهاز الـ vortex.

وبعد عملية الرج الميكانيكي (vortexing) مباشرةً، يتم سحب 2 µL من Eloqua. كرر خطوة الرج الميكانيكي هذه. وفي كل مرة يتم فيها سحب Eloqua، يجب الحفاظ على الجسيمات المغلفة مبردة على الثلج واستخدامها في غضون 15 دقيقة.

بعد تغطية الجسيمات بالـ DNA، ضع 2 µL من الجسيمات عبر الجزء العلوي من مرشح حقنة في منتصف شاشة ترشيح. بعد ذلك، ضع مرشح الحقنة في وحدة تثبيت المرشح داخل غرفة مسدس تدفق الجسيمات أو غرفة PIG. ضع بذرة فاصوليا ليما في وضعية يكون فيها الجانب المحوري متجهًا للأعلى على حاجز يتكون من شاشة مدمجة في قاع كأس زجاجي.

ضع الحاجز، الذي يُستخدم كمنصة لدعم الأنسجة أثناء القصف في غرفة مسدس الجسيمات. ولقصف النسيج، افتح أولاً الصمام المؤدي إلى المفرغة لتفريغ الغرفة. وعندما يصل الفراغ إلى 760 millimeters of mercury، قم بتنشيط الملف اللولبي وتحرير الهيليوم لدفع الجسيمات.

يتراوح ضغط الهيليوم المستخدم لتسريع الجسيمات بين 50 و60 PSI. بعد قذف الجسيمات، أغلق صمام خط التفريغ وحرر التفريغ باستخدام صمام العادم. عند تحرير التفريغ، افتح باب الغرفة لاستعادة co leadin المقذوف وإعادة co leadin a dal side.

استخدم وسط استزراع OMS للتقدير الكمي وتوصيف التعبير الجيني. قم بقصف ثلاث عينات قيادية مشتركة على الأقل لكل بناء DNA. كما يتم تضمين ضابط موجب يعطي توصيفاً جيد الدراسة للتعبير الجيني.

أصبحت الشرائح الآن جاهزة للتصوير. قم بتشغيل مصباح الزئبق وانتظر لمدة 30 minutes حتى يسخن المصباح. قم بتشغيل مصادر الطاقة لكاميرا SPOT R-T-C-C-D ووحدة التحكم في المحرك، التي تقود حركة منصة الروبوتات المصممة خصيصاً، والتي تحمل ثماني أطباق.

قم بضبط مجموعة المرشحات للكشف عن GFP عن طريق اختيار مجموعة المرشحات GFP two عند إثارة بطول موجي 480 nanometers وانبعاث بطول موجي 510 nanometers في مجهر تشريحي من طراز MZ L three. بعد ذلك، قم بتعقيم أغطية أطباق بتري المصنوعة من البولي كربونات السميكة عن طريق رشها بـ 70%ethanol. تمنع هذه الأغطية المتخصصة المستخدمة لتغطية قاعدة طبق بتري حدوث التكثف أثناء جمع الصور.

ضع الأطباق التي تحتوي على cuan المقصفة على المنصة الروبوتية وأحكم ربط مسمار التثبيت الجانبي لتثبيتها في موضعها. الآن، افتح تطبيق البرامج المخصص الذي يتحكم في كل من المنصة الروبوتية وعملية الحصول على الصور. افتح أيضاً مفتاح التحكم في الضوء الأبيض عبر البرنامج، وقم بتوجيه المنصة إلى موضع الأصل.

يتم القيام بذلك قبل تحديد المواضع. لكل مسار توجيهي في علامة تبويب المحرك، اختر الشريحة الأولى. ستقوم المنصة بوضع مركز طبق بتري تحت عدسة المجهر.

باستخدام أزرار مسافة التحريك، حدد بدقة موضع الـ CU LEADIN الأول لجمع الصور. وباستخدام ميزة وضع العرض المباشر، حرك الـ cuddle leaden إلى منطقة العرض المناسبة. وبالنسبة للـ cuddle leaden الأول، استخدم المقابض اليدوية في المجهر التشريحي لضبط التركيز وضبط التكبير على 1.6 x. وبمجرد تحديد المنطقة ذات الصلة، انقر فوق زر إضافة هذا الموضع.

سيقوم البرنامج بإضافة إحداثيات هذه المنطقة إلى ملف جدول المواضع، وستعود المنصة إلى مركز مواضع الطبق المحددة لجميع الـ coens المتبقية على الأطباق. باستخدام أزرار مسافة التحريك، استخدم براغي التسوية اليدوية الثلاثة الموجودة أسفل كل طبق على منصة الروبوت لضبط التركيز للـ coan المتبقية على الطبق نفسه. بعد إدخال جميع إحداثيات كافة الـ coan، احفظ إحداثيات جدول المواضع.

أدخل معايير مجموعة الصور، مثل نوع الضوء، والذي يكون أزرق لبروتين GFP، وإعداد التعريض الضوئي، بالإضافة إلى تحديد مكان تخزين الصور كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المرفق. انتقل إلى علامة تبويب التحكم في وقت الالتقاط وحدد الفاصل الزمني للحصول على الصور والعدد الإجمالي لدورات جمع الصور. وعادةً ما يتم جمع الصور كل ساعة لمدة 100 hours.

توليد ملفات تعريف دقيقة للتعبير الجيني. ابدأ عملية الحصول على الصور من خلال فتح علامة تبويب جدول الموضع ثم النقر على زر تشغيل الجدول. اعزل نظام جمع الصور عن الضوء الخارجي في نهاية فترة جمع الصور التي تستمر لمدة 100 hour.

الصور عالية الدقة، والتي تبلغ سعة كل منها حوالي 5 megabytes، جاهزة الآن للتحليل الصوري. استخدم برنامج image ready لتجميع 100 صورة متسلسلة من كل مجلد. قم باستيراد جميع الصور المتسلسلة كإطارات (frames)، ثم قم بتغيير حجمها إلى 800 × 600 pixels لتسريع عملية معالجة الصور.

بعد ذلك، استخدم علامات على طبقة جديدة مُضافة، تكون مرئية في جميع الإطارات وباستخدام بقع GFP المختارة في المرجع الصوري. قم بمحاذاة كل صورة يدوياً، وعند اكتمال المحاذاة، احذف الطبقة المستخدمة كمرجع واحفظ الملف كملف PSD واحد. كما يجب تصدير جميع الإطارات كملف MOV واحد باستخدام أعلى دقة.

أصبحت الملفات الآن جاهزة لبدء قياس كمية GFP. استخدم برنامج image J لفتح ملف MOV واقتطاع منطقة بمساحة 400 في 300 بكسل. بعد ذلك، افصل الصور المتسلسلة إلى قنوات حمراء وزرقاء وخضراء باستخدام أداة RGB split للقناتين الحمراء والخضراء.

اطرح الفلورة الخلفية باستخدام أداة المكون الإضافي "subtract measured ROI" لكل شريحة. احسب تعبير GFP عن طريق ضبط مستويات العتبة واستخدام مكون إضافي مصمم لقياس متوسط قيمة التدرج الرمادي لكل بكسل والعدد الإجمالي للبكسلات التي تعبر عن GFP. انسخ القيم الناتجة في ImageJ، وأخيرًا الصق القيم الناتجة للقناتين الخضراء والحمراء في Microsoft Office.

استخدم برنامج Excel لمزيد من معالجة البيانات لإعطائك فكرة عن نتائج محاذاة الصور. يوضح هذا الرسوم المتحركة الأول عدم دقة إعادة تموضع المنصة الروبوتية خلال التجربة التي استمرت 100 hour. إن حركة البقعة هي أثر ناتج عن عدم قدرة المنصة الروبوتية على العودة إلى الموضع ذاته تمامًا عند كل نقطة زمنية بعد محاذاة الصور يدويًا، حيث يمكن ملاحظة الخلايا التي تعبر عن GFP بوضوح، كما يمكن تصور الميزات الفريدة لنظام التتبع هذا بسهولة.

بينما يتكرر هذا الرسوم المتحركة، لاحظ خلايا التعبير عن GFP المحاطة بدوائر؛ حيث تظهر الخلية المحاطة باللون الأحمر انخفاضاً سريعاً جداً في التعبير في الفترة من 18 إلى 20 ساعة بعد القصف، بينما تظهر الخلية المحاطة باللون الأبيض بداية متأخرة للتعبير عن GFP. وبالإضافة إلى الرسوم المتحركة، يتيح هذا الإجراء القياس الكمي السريع للتعبير عن GFP بمرور الوقت في النسيج المستهدف للفاصوليا لِيما. وتظهر هذه النتائج النموذجية القياس الكمي المقارن لشدة المحفز باستخدام المحفز CAMV 35 S وأربعة محفزات مختلفة من فول الصويا.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية إدخال الـ DNA في كوتيليدونات البادرات. يتم وضع بذور الفاصوليا البيضاء في الكوتيليدونات على الروبوت، ثم يتم التقاط الصور لتحليلها ومن ثم تحليل تلك الصور. نحن نستخدم هذا الإجراء بشكل روتيني في مختبرنا للتحقق من صحة محفزات النباتات المستنسخة.

يمكن للمرء توليد كمية كبيرة من البيانات من خلال إدخال محفزات نباتية مختلفة. ومع ذلك، فإن هذا الإجراء معقد ويتضمن العديد من الخطوات التي قد تتعرض للخطأ؛ لذا من المهم عند تنفيذ هذا الإجراء البدء ببذور فاصوليا طازجة، أو على الأقل استخدام بذور عالية الجودة تم تخزينها بشكل صحيح. ومن المهم أيضاً الحصول على غطاء طبق بترِي المقطوع لعملية القذف وتركيبه على الروبوت بسرعة، واستخدام غطاء طبق بترِي سميك لتقليل مشكلات التكثف.

وأخيراً، يرجى ملاحظة أن الـ GFP الذي نستخدمه هو إصدار آخر يسمى SGFP، من مختبر Gen HIN بجامعة هارفارد. هذا الـ GFP ليس مستقراً جداً وقد يكون أفضل لتتبع التغيرات السريعة في التعبير الجيني. وهذا كل شيء، شكراً لمشاهدتكم.

مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.