الهندسة الحيوية شبكات الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان في الفئران العوز المناعي

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء شبكة وعائية بشرية في الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك من خلال زراعة الخلايا المكونة للمستعمرات البطانية المشتقة من دم الإنسان والخلايا الجذعية الميزنكيمية المشتقة من نخاع العظم البشري أولاً. بعد ذلك، يتم خلط كلا النوعين من الخلايا في هلام قائم على الكولاجين، والذي يتم حقنه تحت الجلد في فأر يعاني من نقص المناعة.

بعد سبعة أيام، يتم استئصال الغرسة وتقييمها للتحقق من تكوين شبكة وعائية بشرية. وفي النهاية، يمكن التأكد من وجود أوعية دقيقة خاصة بالبشر داخل الغرسات من خلال الفحص النسيجي والكيمياء النسيجية المناعية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بطريقة تقليدية مثل الزرع الجراحي للبنية في أنها بسيطة وسهلة التنفيذ، ولا تتطلب إجراء جراحة.

ابدأ بإذابة أنبوبة واحدة من E CFCs وقم فوراً بتخفيف الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 ملي لتر يحتوي على 10 ملي لتر من DMEM. قم بطرد معلق الخلايا مركزياً بسرعة 1200 RPM لمدة خمس دقائق، ثم أعد تعليق كتلة الخلايا في 10 ملي لتر من وسط EGM two الدافئ. بعد ذلك، انقل الخلايا إلى طبق زراعة أنسجة مقاس 100 ملم مغطى بـ 1% gelatin واحضن الخلايا طوال الليل في حاضنة رطبة.

في الصباح التالي، قم بشفط الوسط وأي خلايا غير مرتبطة برفق. بعد ذلك، قم بتغذية الخلايا المرتبطة بـ 10 milliliters من وسط E GM two الطازج. استمر في هذه العملية على مدار الأيام القليلة القادمة حتى تتشكل طبقة أحادية متلاحمة.

بعد ذلك، اغسل الخلايا بـ 10 milliliters من PBS. استبدل PBS بـ two milliliters من tripsin EDTA وأعد الطبق إلى الحاضنة لمدة خمس دقائق. بعد مرور خمس دقائق، قم بالنقر بلطف على الطبق تحت المجهر وتحقق مما إذا كانت الخلايا قد انفصلت.

وإذا لم يحدث ذلك، كرر عمليات الحضن القصيرة مع الرج اللطيف. وبمجرد انفصال الخلايا تماماً، أضف ثمانية ملليلترا من وسط EGM two إلى الخلايا وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. قم بعدّ الخلايا ثم قم بتدويرها بسرعة 1200 RPM لمدة خمس دقائق.

قم الآن بنقل الخلايا إلى أطباق زراعة الأنسجة المغلفة بـ 1% gelatin بكثافة استزراع تبلغ 5, 000 cells لكل سنتيمتر مربع. قم بحضن الخلايا في وسط EGM two medium، وقم بتغذيتها كل يومين إلى ثلاثة أيام باستخدام وسط EGM two medium. كرر هذا الإجراء في الممرات اللاحقة ما بين الممر الرابع والثامن.

ستكون خلايا E CFCs جاهزة للاستخدام. كما يمكن استخدام هذا البروتوكول لتنمية الخلايا الجذعية الوسيطة MSCs، وذلك ببساطة عن طريق استبدال الوسط E GM two بالوسط M-S-C-G-M.

استخدم طبق زراعة غير مطلي. ابدأ بعملية الزراعة الفرعية عند وصول الخلايا إلى درجة تلاقي 80%، وقم بالزراعة الفرعية بكثافة استزراع تبلغ 10,000 خلية لكل سنتيمتر مربع. تتطلب هذه التجربة 800,000 من خلايا E CFCs و 1,200,000 من خلايا MSCs لكل غرسة.

بشكل عام، يتم تحضير خمس غرسات في آن واحد. للبدء، قم بشفط الوسط الخلوي من أطباق الزرع، واغسل كل طبق من الخلايا بـ 10 milliliters من PBS. استبدل PBS بـ two milliliters من trypsin EDTA واحضن الأطباق مع الهز اللطيف.

افحص الخلايا تحت المجهر كل دقيقتين إلى خمس دقائق حتى تنفصل جميع الخلايا. ثم أضف 8 milliliters من DMEM واجمع محلول الخلايا. وفي أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter، قم بعدّ الخلايا وانقل عدداً كافياً من الخلايا لخمس غرسات إلى أنبوب مخروطي واحد سعة 15 milliliter.

بعد ذلك، قم بطرد الخلايا مركزياً بسرعة 1200 RPM لمدة خمس دقائق وأزل السائل الطافي. قم بتحضير خليط من fibrinogen وcollagen fibronectin بعناية على الثلج. ثم قم بإعادة تعليق كتلة الخلايا برفق شديد في الخليط المبرد بالثلج.

قم بتحميل معلق الخلايا في سرنجة سعة واحد ملليلتر مع تجنب تكوين فقاعات هوائية، ثم ركب إبرة مقاس 26 ذات غطاء. احتفظ بالسرنجة المحملة على الثلج حتى يتم حقن خليط الخلايا. تم تخدير أربعة فئران عارية ناقصة المناعة وغير تيموسية تبلغ من العمر ستة أسابيع باستخدام غرفة ISO fluorine.

بمجرد تخدير الفئران وعدم استجابتها لقرصة الإصبع، ابدأ بعمليات الحقن لكل فأر. استخدم إبرة قياس 30 gauge لحقن 50 µL من محاليل الثرومبين تحت الجلد في المنطقة الظهرية العلوية. وفي الموقع نفسه، احقن 200 µL من خليط الخلايا.

باستخدام إبرة قياس 26، ستتحول الجزيئات الكبيرة المحقونة إلى هلام وتُشكل نتوءاً صغيراً ولكن ملحوظاً تحت الجلد. بعد الحقن، ضع الفئران على طبقة من الشاش لتوفير الراحة والدفء. راقبها حتى تستعيد قدرتها على الحركة.

على مدار الأيام الثلاثة التالية، قم بإجراء ملاحظة يومية للحالة الصحية العامة للحيوان. وبعد أسبوع واحد من الحقن، يتم القتل الرحيم للفئران باستخدام ثاني أكسيد الكربون وإزالة السدادة الهلامية جراحياً. وبمجرد استخراجها، قم بتصوير السدادات الهلامية بجانب مسطرة، ثم ضع كل سدادة هلامية في كاسيت نسيجي واغمرها في محلول 10% neutral buffered formalin طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.

في اليوم التالي، اغسل الفورمالين المنظم المتعادل بنسبة 10% باستخدام الماء المقطر. تُحفظ الكاسيتات في محلول PBS عند درجة حرارة أربع درجات مئوية حتى يتم تقييمها نسيجياً. قم بإعداد مقاطع بسمك سبعة ميكرون من الغرسة المغمورة في البارافين.

ثم قم بقياس كثافة الأوعية الدقيقة في الجزء الأوسط من الغرسات. وباستخدام صبغة H and e، قم بحساب عدد الأوعية لكل مليمتر مربع لإثبات الطبيعة البشرية للأوعية الدموية الدقيقة. صبغ المقاطع باستخدام جسم مضاد anti-human CD 31 متاح تجارياً بتخفيف 1:100.

تُظهر هذه الصورة المجهرية بتباين الطور المورفولوجيا المميزة التي تشبه رصيف الشارع للخلايا البطانية في طبقة أحادية متصلة نموذجية من خلايا e CFCs المشتقة من دم الحبل السري. وتُظهر هذه الصورة المورفولوجيا المغزلية النموذجية للخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) المشتقة من نخاع العظم البشري. وبعد فترة حضانة استمرت لمدة أسبوع في المضيف الفأر، بدا الغرسة المحددة بخط أصفر متقطع مختلفة تماماً عن أنسجة المضيف عند التكبير العالي.

كشفت النتائج عن وجود عدة أوعية دقيقة تظهر هياكل تجويفها محتوية على خلايا دم حمراء، وهي موضحة برؤوس السهام الصفراء. وعند فحص السدادات كيميائياً نسيجياً مناعياً، تبين أن تجويف الأوعية الدقيقة كان تفاعلياً مع جسم مضاد أحادي النسيلة لـ human CD 31. وقد تم صبغ أنوية الخلايا بصبغة الهيماتين كصبغة تباينية.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون أونصة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.