CD4 + T - اللمفاويات التقاط باستخدام رقاقة ميكروفلويديك المتاح لفيروس نقص المناعة البشرية

مرحباً، اسمي ريتشارد لين وأنا باحث هنا في مجموعة البروفيسورة TI Mercy في قسم العلوم الصحية والتكنولوجيا في جامعة هارفارد ومعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا. المشروع الذي أعمل عليه هو قياس وعزل الخلايا التائية اللمفاوية الإيجابية لـ CD four والإيجابية لـ C3. سيتم استخدام دم المرضى في البيئات محدودة الموارد.

أمامنا هنا جهاز ملء دقيق (microfill) مكون من مادة PDMS، وهي بولي ثنائي ميثيل السيلوكسان. يبلغ ارتفاع القناة في الجهاز 50 µm، والحجم الإجمالي داخل الجهاز هو 10 µL. لذا، فإن هذا الجهاز دقيق للغاية وسنستخدمه لالتقاط الخلايا اللمفاوية التائية المساعدة (T helper lymphocytes).

بشكل أساسي، يمثل هذا المعيار التشخيصي لمرضى HIV. لقد تم بالفعل تحضير سطح جهاز الموائع الدقيقة بالبروتين، مع وجود أجسام مضادة إيجابية لـ CD4 في المحقنة. لدينا الآن محلول PBS المنظم البيولوجي عند pH 7.4، وسنقوم بتدفيقه في القناة لغسل الأجسام المضادة الإيجابية لـ CD4 الزائدة.

في هذه المرحلة، لا نحتاج إلى التحكم في المعدل لأننا نحاول فقط غسل المواد الزائدة، ولا يهم حقاً ما هو المعدل المستخدم. هنا ستكون مداخل الجهاز، وستكون هذه هي المخرجات إلى يساري وإلى يمينكم هنا. والآن سأقوم بغسل محلول الجسم المضاد الزائد، وإذا لاحظتم من المخرج، ستجدون السائل يتدفق للخارج؛ هذه كمية ضئيلة جداً، ولكن إذا نظرتم عن كثب، يمكنك رؤية السائل يخرج من القناة عبر الأنبوب.

والآن بعد أن قمنا بغسل محلول الأجسام المضادة الزائد، يمكننا الآن التحضير لضخ الدم. لذا سأقوم الآن بفصل الأنابيب من المدخل. ثم سنفتح سرنجة جديدة تحتوي على الدم، وهو دم بشري كامل.

إذًا هذه ليست عينة مريض، بل هي عينة سليمة من شخص سليم، بينما نجهز أنفسنا لحقن الدم في جهاز الموائع الدقيقة. سنقوم الآن بتثبيت المحقنة في مضخة المحقنة. سنقوم بتشغيلها الآن، ويمكنكم رؤية معدلات تدفق المحقنة والتي ضبطناها لتكون 5 µL في الدقيقة.

وسنقوم الآن بشكل أساسي بتجهيز أنفسنا للحقن في الدم. سنضع مضخة السرنجة بشكل رأسي لأننا نعلم أن خلايا الدم تترسب، ونحن نريد أن تتدفق الخلايا إلى القناة؛ لذا فإننا نفضل أن تترسب الخلايا في القاع، وهو الموقع القريب جداً من الأنابيب الخاصة بنا.

لقد تم الآن إعداد كل شيء وأصبح جاهزاً للبدء. تبلغ سعة جهازي 10 µL لكل 10 µL، كما أن الحجم الذي نريد تدفيقه إلى جدار القناة هو أيضاً 10 µL.

لذا يمكنني معرفة ما إذا كنت قد تدفقت كمية كافية من الدم بمجرد النظر إلى لون القناة؛ فإذا كانت حمراء بالكامل وممتلئة، سأعلم أنني قد دفقت 10 µL ويجب عليّ إيقاف مصد المحقنة. سأضغط الآن على زر البدء وسيبدأ التدفق، وأحياناً يستغرق الأمر بعض الوقت قبل أن يدخل الدم فعلياً إلى القناة، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى الضغط.

على سبيل المثال، عند وضع المحقنة، قد نقوم أحياناً بسحب أو حقن السائل وفقاً لذلك لضبط كمية الدم في الأنابيب. لذا، قد يستغرق الأمر بعض الوقت، ولكن بمجرد أن يبدأ الضخ في القناة، يتم ضبط معدل التدفق عند ly لكل دقيقة، وهو المعدل المطلوب. لذا، قد نحتاج إلى التحلي ببعض الصبر والانتظار، فأحياناً يتعين عليك الانتظار لمدة دقيقتين أو ثلاث دقائق قبل أن يبدأ الدم في التدفق إلى القناة.

في الواقع، يمكنك أن ترى الآن أن الدم بدأ يتدفق داخل القناة. لذا، يمكن القول الآن إن الجهاز قد امتلأ بالكامل تقريباً. حسناً، سنقوم الآن بإعادة توصيل الأنابيب بمحلول PBS لغسل الدم الموجود في القناة.

وللقيام بذلك، سنكرر ما فعلناه مسبقاً لإزالة الأنابيب. وبما أننا لا نزال بحاجة إلى التحكم في معدل تدفق PBS، فإننا لا نزال بحاجة إلى مضخة المحقنة. ومع ذلك، وبما أننا لم نعد نقوم بتدفق الدم، فلا داعي لإبقاء مضخة المحقنة في وضع عمودي لعدم وجود خلايا في PBS.

لقد انتهينا من كافة التجهيزات، وسنقوم الآن بغسل الدم من الجهاز، وسأضغط على زر الشفط مرة أخرى هنا. وكما ترون، بدأ الجهاز في التنظيف؛ لا تزال هناك كمية قليلة من الدم عند الحواف، ولكنها تتلاشى تدريجياً.

بمجرد سحب كل الدم، سنقوم بزيادة المعدل من 5 µL/min إلى 20 µL/min. والسبب في هذا التغيير هو وجود نوعين من الخلايا في الدم يحملان مستضدات C4 إيجابية؛ أحدهما هو ما نبحث عنه، وهي الخلايا اللمفاوية التائية المساعدة.

أما النوع الآخر فهو ما نسميه الخلايا الوحيدة. نريد التأكد من أن جهازنا يلتقط تحديداً الخلايا اللمفاوية التائية المساعدة فقط، بدلاً من التقاط كل من الخلايا اللمفاوية التائية المساعدة والخلايا الوحيدة. والطريقة التي نقوم بها بذلك هي زيادة معدل التدفق لأننا نعلم أن الخلايا الوحيدة أكبر حجماً من الخلايا التائية المساعدة.

وبالتالي، فمن خلال زيادة معدلات التدفق، ستتعرض الوحيدات الأكبر حجماً لضغط أكبر لمغادرة السطح مقارنة بالخلايا التائية المساعدة الموجبة لـ CD4. والآن، استغرق الأمر ما يقرب من 20 دقيقة. وما أحمله في يدي الآن هو محلول.

يُسمى هذا المحلول محلول تحلل كريات الدم الحمراء. والغرض منه في هذه العملية هو تحلل كريات الدم الحمراء؛ ففي أي مكان تتبقى فيه كريات دم حمراء في القناة، سيعمل هذا المحلول على تحللها.

تم تخفيف هذا المحلول بمقدار 10 أضعاف من المحلول المخزون. لذا، سنقوم الآن بإيقاف مضخة المحقنة، وإزالة الأنابيب، واستبدال المحلول بالموجود في هذه المحقنة. سأقوم الآن بإيقاف الجهاز، وإزالة الأنابيب، وفصلها، ثم توصيلها بهذه المحقنة، واستبدالها بواحدة جديدة.

حسناً، بعد أن انتهيت من إعداد كل شيء، سنقوم الآن بخفض المعدل ليعود إلى 5 µL في الدقيقة. لذا، سنقوم بتغيير المعدل من 20 إلى 5، والآن سنقوم بتدفق محلول fax license لمدة 20 دقيقة. وسنضغط الآن على زر البدء.

أمامنا الآن صورة بصرية للجهاز تم التقاطها بتكبير 10x. حيث يمكنكم رؤية كل هذه النقاط البيضاء هنا. إذًا، كيف يمكننا التأكد من أن هذه الخلايا هي التي نبحث عنها؟

لذا نستخدم بضعة صبغات مختلفة للتأكد؛ الصبغة الأولى التي نستخدمها هي ما نسميها DPI، وهي صبغة تصبغ النواة. وبشكل أساسي، فإن أي خلايا تحتوي على نواة، مثل خلايا الدم البيضاء، ستُصبغ، بينما خلايا الدم الحمراء التي لا تحتوي على نواة لن تُصبغ، ويمكنك ملاحظة ذلك عبر الصورة بأكملها، حيث تظهر كل هذه النقاط الزرقاء، وكل واحدة منها مصبوغة باللون الأزرق.

هي خلية. لذا فإن الخطوة التالية الآن هي التحقق مما إذا كانت الخلايا تحتوي على ما نسميه المستضد C four الموجب. هذا أمر بالغ الأهمية لأن الغرض الكامل من جهازنا هو التقاط الخلايا الموجبة لـ C four.

لذا، فإن الجسم المضاد الفلوري التالي الذي نستخدمه بالطبع هو النوع النوعي لـ C four. وانتقلوا إلى الشريحة التالية. لذا في هذه الصورة، تظهر الخلايا المصبوغة باهتة أكثر لأن الجسم المضاد الفلوري الذي نستخدمه عادةً هو for facts.

وبالتالي فإن درجة التخفيف أعلى بكثير. ولكن إذا نظرت بدقة، يمكنك أن تلاحظ أنه لا تزال هناك نقاط متناثرة في هذا المجال الرؤيوي، وهي باهتة إلى حد ما.

ولكن عند الفحص الدقيق يمكننا التأكد من أن هذه الخلايا موجبة لـ DC، وهو أمر جيد لأن هذا هو بالضبط ما نريده. والاختبار التالي هو، كما ذكرت سابقاً، وجود نوعين مختلفين من الخلايا الموجبة لـ C four؛ أحدهما هو النوع الذي نريده وهي الخلايا التائية المساعدة، والنوع الآخر هو ما نسميه الخلايا الوحيدة.

لذلك نحتاج مجددًا إلى جسم مضاد فلوري آخر للتمييز بين الخليتين. فنحن نعلم أن الخلايا اللمفاوية التائية المساعدة تحتوي على ما نسميه مستضدات CD3 الموجبة، بينما لا تحتوي عليها الخلايا الوحيدة.

الأجسام المضادة التالية التي سنستخدمها هي الخاصة بـ CD3، والتي سنراها في هذه الصورة. مجددًا، يمكنكم ملاحظة وجود نقاط منتشرة حول الجهاز، وتبدو هذه النقاط أكبر حجمًا لأن بعض الخلايا تظهر أحيانًا بسطوع أكبر من غيرها. أعني أن الكثير من الأمور تعتمد على الصدفة في هذه الحالة، ولكن في معظم الحالات، تكون هذه النقاط، وهي النقاط الحمراء الساطعة، عبارة عن خلايا.

لذا، نريد مجدداً، أولاً، التأكد من أن خلايانا موجبة لـ CD4 وموجبة لـ CD3. وفي هذه الحالة، يمكنك أن تلاحظ أن الكثير من خلايانا موجبة لـ CD3، وهو أمر جيد، حيث يمنحنا ذلك خصوصية في عملية الالتقاط.

النقاط الكبيرة قد تكون مجرد شوائب، ولكن في كثير من الأحيان يحدث أن تجمع خلية ما بالصدفة المزيد من CD3، أي يتجمع CD3 عليها. لذا، في هذه الصورة، هذه واحدة من البيانات التي جمعناها لهذا الجهاز للموائع الدقيقة، وهو أساساً بروتوكول لالتقاط الخلايا. لذا، في الشرائح السابقة وما إلى ذلك، يمكنك أن تلاحظ وجود الكثير من الصور التي تحتوي على خلايا.

ولكن ما الذي تتراكم إليه هذه البيانات في النهاية؟ حسناً، إنها تتراكم لتشكل ملف تعريف لالتقاط الخلايا، وفي هذه الحالة يمكننا رسم محور X ليمثل المسافة من المدخل، ومحور Y ليمثل قرص التقاط الخلايا. ويمكنك أن تلاحظ أنه على امتداد الجهاز، تكون الكثافة في البداية عالية جداً ثم تنخفض تدريجياً، وهذا هو ما نتوقعه لأننا نقوم بالتقاط الخلايا الموجبة لـ C4 والموجبة لـ C3 من مجرى الدم، ومن ثم سيكون هناك تركيز متناقص من هذه الخلايا في عينة الدم.

وهذه هي الطريقة التي تُعرض بها بياناتنا عادةً بشكل أساسي.