RNA-يليها تحليل Transcriptomes في المعاملة والثرومبين الإنسان الرئوي مراقبة الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقديم عملية كاملة ومفصلة لتطبيق RNA-Seq ، وهي تقنية قوية لتسلسل الحمض النووي من الجيل التالي على نسخ الملف الشخصي. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الحمض النووي الريبي الكلي أولا عن الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة الرئوية البشرية مع أو بدون علاج الثرومبين والتحقق من جودة الحمض النووي الريبي. الخطوة الثانية هي إنشاء مكتبات الحمض النووي من عينات الحمض النووي الريبي هذه.

قم بتبسيط إنشاء الكتلة باستخدام أداة cbot وقم بتنفيذ مهمة تسلسل الحمض النووي على HighSeq 1000. يتم إجراء تحليل البيانات التالي لتحديد وعرض النصوص الجينية المعبر عنها بشكل تفاضلي في النهاية. الخطوة الأخيرة هي التحقق من صحة نتائج RN aeq بواسطة RT TP CR. الميزة الرئيسية ل IC على الطرق الحالية مثل مصفوفة الحمض النووي الدقيقة لتحليل النسخ هي أن IC يمكنه تحديد ملف تعريف نسخ كامل ، وتوفير نوع رقمي من البيانات ، وعدم الاعتماد على أي تكوين جيني معروف للتعبير الجيني في الخلايا.

بينما يعد قياس مستوى MRA أداة مفيدة في تحديد كيفية تأثر نسخ آلية الخلية بالإشارات الخارجية أو كيف تختلف الخلايا بين الحالة الصحية والحالة المرضية. في هذا البروتوكول ، سنوضح تحليل IC للنسخ في التروبين المعالج والتحكم في الخلايا الهندية الاحتزامية للأوعية الدموية الدقيقة الرئوية البشرية. يعتمد هذا البروتوكول على دراستنا المنشورة مؤخرا والتي نجحنا فيها في إجراء أول تحليل كامل للنسخ للخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة الرئوية البشرية المعالجة بالثرومبين باستخدام RNA-Seq على High SEQ 1000 ، وهي منصة شهيرة لتسلسل الحمض النووي من الجيل التالي.ستعرض السيدة

سومان شاها تسلسل الحمض النووي على أداة SEQ 1000 العالية ، بالإضافة إلى تجربة التحقق من صحة R-T-P-C-R. باستخدام نظام VS سبعة R-T-P-C-R ، سيوضح الدكتور دينوفا علاج الثرومبين للخلايا البطانية الرئوية البشرية والأوعية الدموية الدقيقة وعزل الحمض النووي الريبي الكلي للخلية.ستعرض السيدة مارغريت جيبسون نظام Experian للتحقق من جودة الحمض النووي الريبي ومكتبة الحمض النووي بالإضافة إلى توليد الكتلة على cbot.

وسيوضح الدكتور ديميتري جريجور تحليل البيانات لبدء ثقافة البروتوكول هذه. الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة للرئة البشرية إلى ما بين 90 و 100٪ التقاء في ستة ألواح آبار في EGM متوسطان مع 5٪ FBS عوامل النمو والمضادات الحيوية. تغيير الوسائط إلى وسائط التجويع قبل 30 دقيقة من العلاج بالثرومبين.

بعد 30 دقيقة ، عالج الخلايا ب 0.05 وحدة لكل مليلتر ، أو ثرومبين ، أو اتركها دون علاج كعنصر تحكم. احتضان الخلايا لمدة ست ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد علاج لمدة ست ساعات.

عزل الحمض النووي الريبي الكلي من الخلايا المعالجة والضابطة باستخدام مجموعة نيرفانا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتقييم جودة الحمض النووي الريبي باستخدام شريحة الحمض النووي الريبي حقيقية النواة ذات الإحساس القياسي Experian وفقا للبروتوكول القياسي في محطة الرحلان الكهربائي الآلي Experian. أخيرا ، حدد كمية الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة القياس الضوئي الطيفي القياسية لبناء المكتبة.

استخدم ميكروغرام واحد من الحمض النووي الريبي الكلي عالي الجودة لكل عينة كمادة أولية لبناء المكتبة. اتبع البروتوكول القياسي للشركة المصنعة. في هذا البروتوكول ، يتم إجراء جولتين من البولي تحتوي على اختيارات Mr.mRNA.

لإزالة الحمض النووي الريبي الخاص بنا لتقليل تسلسل الحمض النووي الريبي لدينا ، قم بتقييم جودة المكتبات باستخدام شريحة Experian DNA one K. وفقا للبروتوكول القياسي في محطة الرحلان الكهربائي الآلي Experian. تحديد كمية المكتبة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي.

مختصر Q-R-T-P-C-R كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. مع هذا الفيديو ، قم بتشغيل Q-R-T-P-C-R وفقا لبروتوكول cyber green MM واحسب تركيز المخزون الأصلي لكل مكتبة. خفف مخزون المكتبة إلى 10 نانومولار وخزنها على حرارة 20 درجة مئوية.

عندما تكون جاهزا لتجميع خلية التدفق ، قم بإذابة لوحة كاشف cbot في حمام مائي. CBOT هي أداة تستخدم لتبسيط عملية إنشاء المجموعة. بعد غسل أداة cbot ، قم بتغيير طبيعة المكتبات عن طريق الجمع أولا بين 13 ميكرولترا من XTE واحد وستة ميكرولترات من 10 نانومولار.

ثم إلى جانب كل أنبوب ، أضف ميكرولتر واحد من هيدروكسيد الصوديوم العادي ، وقم بتدوير الأنابيب لأسفل واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم ضع المكتبات المشوهة على الجليد. بعد ذلك ، قم بتخفيف المكتبات المشوهة باستخدام مخزن مؤقت للتهجين المبرد مسبقا عن طريق الجمع بين 996 ميكرولتر من المخزن المؤقت و 4.0 ميكرولتر من المكتبة المشوهة للحصول على تركيز نهائي يبلغ 12 ميكرولتر من البيكو المولار.

ضع المكتبات المخففة المشوهة. ثم اقلب كل صف من أنابيب لوحة cbot ، مع التأكد من إذابة جميع الكواشف. بعد تدوير اللوحة ، قم بإزالة ختم الرقائق من صف أنابيب هيدروكسيد الصوديوم وقم بتحميله على cbot aliquot.

120 ميكرولترا من المكتبات المخففة المشوهة إلى أنبوب شريطي يسمى من واحد إلى ثمانية. أضف 1.2 ميكرولتر من مكتبة التحكم PHI X المخففة المكسوة إلى كل أنبوب كارتفاع في التحكم. بعد الدوامة والدوران لأسفل ، قم بتحميلها على cbot في الاتجاه الصحيح مع الأنبوب رقم واحد إلى اليمين.

قم بتحميل خلية تدفق ومشعب على cbot. أكمل فحص التدفق وابدأ تشغيل التجميع. بعد اكتمال التشغيل، تحقق من تسليم الكاشف عبر جميع الممرات.

دون أي تشوهات. إما أن تبدأ تشغيل التسلسل على الفور أو قم بتخزين خلية التدفق في الأنبوب المقدم عند أربع درجات مئوية. لبدء التسلسل.

قم بإذابة التسلسل بواسطة الكواشف التوليفية. قم بتحميل الكواشف في الأماكن المناسبة على صواني الكاشف ، مع التأكد من عدم لمس الكواشف الأخرى. بعد لمس مزيج الانقسام ، باستخدام خلية تدفق غير تسلسل ، قم بتنظيف خطوط الكاشف مرتين تماما خلية تدفق التسلسل باستخدام 70٪ من الإيثانول ومناديل كيم ، متبوعة بنسبة 70٪ من الإيثانول وورق العدسة.

افحص خلية التدفق بحثا عن أي خطوط وأعد تنظيفها إذا لزم الأمر. قم بتحميل خلية التدفق على جهاز التسلسل وقم بإجراء فحص التدفق للتأكد من أن الختم بين المشعبات وخلية التدفق محكم. ابدأ تشغيل التسلسل.

قم بتقييم مقاييس الجودة عند توفرها أثناء تشغيل مراقبة شدة طوال التشغيل. بعد اكتمال 101 دورة. قم بإجراء كيمياء التحول لإكمال القراءة الثانية.

الأب الأول المزدوج والكواشف ، والثاني يقرأ المخزن المؤقت للتأسيس. ثم قم بتحميل الكواشف ، واستمر في التسلسل ، وقم بإجراء التقييم. ثانيا ، اقرأ كثافة Q3 ومقاييس الجودة الأخرى مع تقدم التشغيل.

لبدء تحليل البيانات ، استخدم أحدث إصدار من الكسافا لتحويل ملفات المكالمات الأساسية إلى ملفات FAST Q. تعيين عدد مجموعات Q السريع إلى الصفر لضمان إنشاء ملف Q سريع واحد. لكل عينة، قم بفك ضغط ملفات Q السريعة لتحليل المصب.

قم بإجراء الاقتران والمحاذاة باستخدام أحدث إصدار من القبعة العلوية ، والتي تقوم بمحاذاة قراءات RNA-Seq مع جينومات حجم الثدييات باستخدام أدوات القراءة القصيرة ذات الإنتاجية العالية للغاية وأدوات SAM ، والتي تنفذ العديد من الأدوات المساعدة لمحاذاة ما بعد المعالجة بتنسيق SAM. يمكن تنزيل النسخ البشري المرجعي من الجينوم الأول في تشغيل القبعة العلوية ، وقد تم استخدام جميع إعدادات المعلمات الافتراضية ، بما في ذلك خيار نوع المكتبة كجزء غير مجدول باستخدام جزء فرق الكفة من حزمة برنامج أزرار الأكمام. قارن الخلايا المعالجة بالثرومبين بخلايا التحكم.

قم بفحص النصوص الجينية المعبر عنها تفاضليا في الخلايا المعالجة بالثرومبين بناء على النسخ المرجعي البشري. ثم استخدم جدول بيانات لتصور النتيجة في شكل جدول. في هذه الحالة ، تم استخدام جميع إعدادات المعلمات الافتراضية وتم تصفية نصوص الجينات التي تحتوي على FPKM أقل من 0.05 و p أكبر من 0.05 للكشف عن روابط الأكمام التي تعمل بالأشكال الإسوية الجديدة بدون مرجع.

يقارن Transcriptome نماذج ملفات النسخ بالجينوم المرجعي باستخدام مقارنة الكفة. اختبر التعبير التفاضلي باستخدام فرق الكفة باستخدام ملفات نسخ الثرومبين المدمجة كجينوم مرجعي لتحليل واحد وملفات نسخ التحكم المدمجة كجينوم مرجعي لتحليل ثان ، مرة أخرى ، استخدم جدول بيانات لتصور النتيجة بتنسيق جدولي. كما كان من قبل ، تمت تصفية تلك النصوص الجينية التي تحتوي على FPKM أقل من 0.05 و p أكبر من 0.05.

بعد هذه الخطوة ، قد يختار المحققون تحميل قائمة بالنصوص التي تم الإبلاغ عنها حديثا على موقع الويب الخاص بمتصفح الجينوم UC SC للتحقق من صحتها عن طريق الفحص اليدوي. يمكن أيضا تقديم قوائم الجينات المعبر عنها تفاضليا لتحليل مسار الإبداع لتوصيف الجينات والمسارات المتأثرة بعلاج الثرومبين. في هذه الخطوة ، قد يختار الباحثون استخدام cummerbund حزمة R المصممة للمساعدة في مهمة تحليل أزرار أكمام RN aeq للمساعدة في إدارة وتصور ودمج جميع البيانات الناتجة عن تحليل فرق الكفة.

يتم إجراء التحقق من صحة نتائج RN aeq بواسطة Q-R-T-P-C-R أولا ، وإجراء عزل كامل للحمض النووي الريبي عن التحكم ومعالجة الثرومبين للخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة للرئة البشرية ، وتقييم جودة الحمض النووي الريبي وقياس الحمض النووي الريبي كما هو موضح سابقا في الفيديو. ثم قم بإنشاء حمض نووي مجاني من ميكروغرام واحد من إجمالي الحمض النووي الريبي لكل عينة باستخدام نظام توليف الخيوط الأولى المرتفع بثلاثة خطوط مرتفعة باتباع تعليمات الشركة المصنعة. أخيرا ، قم بإجراء تحليل Q-R-T-P-C-R على VI ، وهو سبعة نظام PCR في الوقت الفعلي باستخدام مقايسة TAC MAN عند الطلب النيوكليوتيدات المصممة المدرجة في البروتوكول المكتوب المصاحب لهذا الفيديو وقياس الكمية كما هو موضح هناك.

تستخدم نسبة 28 ثانية إلى 18 ثانية تقليديا كمؤشر لتدهور الحمض النووي الريبي لتحديد التدهور بدقة أكبر ، يحسب نظام الخبرة مؤشر جودة الحمض النووي الريبي أو رقم RQI. تقارن خوارزمية RQI المخطط الكهربي لعينات الحمض النووي الريبي ببيانات من سلسلة من عينات الحمض النووي الريبي المتدهورة القياسية وتعيد تلقائيا رقما بين 10 وواحد. يجب أن تحتوي عينة الحمض النووي الريبي على معدل RQI لا يقل عن سبعة وأكبر من ثمانية.

تشير نتائج Experian هذه إلى عينة RNA عالية الجودة مع RQI 8.4. يجب أن تحتوي المكتبات على نطاق عريض يبلغ حوالي 250 إلى 300 زوج أساسي كما هو موضح في هذا الشكل من نتائج Experian لمكتبة عالية الجودة. هنا ، يتم عرض نتائج Q-R-T-P-C-R لعينات المنحنى القياسية وعينة واحدة غير معروفة.

يجب ملاحظة تقدم وجودة تشغيل التسلسل باستمرار طوال فترة التشغيل. يوضح هذا الشكل كثافة العنقود المناسبة خلال خطوة تصوير الدورة الأولى. هذا هو المؤشر الأول على الجري.

يجب أن تكون مجموعات الجودة مشرقة ومركزة. يتم عرض مثال على التقرير الأساسي الأول الذي تم إنشاؤه بعد الانتهاء من الدورة الأولى. من المهم تقييم مستويات كثافة الكثافة العنقودية المقدرة وجودة التركيز في هذه المرحلة.

نقطة تفتيش الجودة التالية بعد الدورة الرابعة هنا. يوضح هذا كثافة العنقود المطلقة لكل حارة. وينبغي ألا تزيد كثافة العنقود عن 850 كلفن لكل ملليمتر مربع بعد الدورة 13.

يتم حساب إحصائيات المراحل وما قبل المراحل. تتراوح الأرقام النموذجية بين 0.1 و 0.25. يمكن إجراء تقييم الجودة الرئيسي بعد الدورة 24 عندما يتم حساب العديد من مقاييس الجودة.

النسبة المئوية للقراءات فوق Q3 هي مقياس للثقة في القاعدة. يعني استدعاء قراءة بدرجة Q من ثلاثة أن هناك فرصة واحدة في 1000 أن تكون المكالمة الأساسية خاطئة. ستنخفض درجات Q مع تقدم التشغيل ، ولكن يجب أن تبدأ بأكثر من 95٪ من القراءات التي تلتقي أو تتجاوز Q3. مرشح تمرير المجموعات أو pf هي المجموعات التي سيتم أخذ بيانات التسلسل الفعلية منها.

من الناحية المثالية ، يجب أن يكون هذا أعلى من 85٪ يعتمد نظام المجموعة pf على العديد من العوامل بما في ذلك المراحل ، وكثافة المراحل المسبقة ، ولن يتغير Q3.It مع تقدم التشغيل. النسبة المئوية للمحاذاة هي مقياس للقراءات التي تتوافق في الوقت الفعلي مع جينوم FI x. نظرا لأن ما يقرب من 1٪ FI x تم إدراجها في مكتبات العينات، يجب أن تكون النسبة المئوية لمحاذاة بين 0.5 وواحد.

تظهر هذه الإحصائية أن محتوى المكتبة يتم تمثيله بشكل جيد من خلال المجموعات ولم يكن هناك تحيز لتوليد الكتلة المدرجة هنا يتم التعبير عن الجينات والأشكال الإسوية في كل من الخلايا البطانية الرئوية الدقيقة المعالجة بالثرومبين. والجدير بالذكر أن هناك حوالي 26,000 شكل إسوي جديد تم اكتشافه ، مما يوضح قوة RN aeq. يمكنه تحديد الحمض النووي الريبي غير المعروف.

بدلا من ذلك ، النصوص المقسمة واستخدام المروج البديل ، والتي لا يمكن اكتشافها بواسطة تقنيات المصفوفات الدقيقة. يمكن ل RNA-Seq أيضا قياس النصوص الأقل وفرة التي يتم تحديدها بشكل غير دقيق أو كميا أو لم يتم اكتشافها بواسطة المصفوفات الدقيقة للتحقق من صحة نتائج RNA-Seq باستخدام نهج بديل. تم إجراء تجربة A-Q-R-T-P-C-R لفحص ثلاثة جينات مختلفة في بيانات RNA-Seq تم تنظيم TR واحد بمقدار 7.96 ضعفا ذاتيا.

تم تخفيض تنظيم أحدهما بمقدار 1.16 ضعفا وشكر اثنين تم خفضهما تنظيمهما بمقدار 1.70 ضعفا في بيانات Q-R-T-P-C-R ، وهذه الأرقام المقابلة هي زائد 7.25 ضعفا ناقص 1.15 ضعفا وناقص 2.07 ضعفا على التوالي. تتفق نتائج هذه الجينات الثلاثة التي تم فحصها بواسطة RNA-Seq و Q-R-T-P-C-R بشكل جيد ، مما يؤكد نتائج RNA-Seq. هذا البروتوكول خاص ب IC في نقطة زمنية واحدة من الأوعية الدموية الرئوية البشرية المعالجة في الخلايا الكبيرة ، ولكن يمكن تكييفه بسهولة مع دراسة أو دراسات متعددة النقاط الزمنية في أنسجة الخلايا الأخرى المعالجة بمحفزات أو مثبطات مختلفة أو مقارنة النسخ في الخلية أو الأنسجة بين الحالة السليمة وحالة المرض.

في حين أنه خاص ب SQ 1000 العالي ، فإن هذا البروتوكول ينطبق على أي من عائلة HighSeq أو محلل الجينوم. أداتان مع تعديلات طفيفة على خطوات توليد الكتلة وكواشف التسلسل. منصات تسلسل الحمض النووي الأخرى من الجيل التالي مثل السلسلة الصلبة.

أيضا استخدام أنظمة GS ، بالإضافة إلى بعض الأنظمة الأحدث الناشئة لغرض RNA-Seq. على الرغم من أن إجراءات بناء المكتبة والتسلسل قد تكون مختلفة قليلا ، إلا أن نصائح معالجة الحمض النووي الريبي وأجزاء تحليل البيانات والتحقق من الصحة بواسطة R-T-P-C-R المقدمة في هذا البروتوكول يمكن أن تكون ذات قيمة مرجعية لتطبيقات RNA-Seq الخاصة بهم.