Microfabricated بعد صفيف ، للكشف عن (mPADs) : نهج لعزل القوات الميكانيكية

مرحباً، أنا ناثان سنيا ديكي، ومعي اليوم ويس ليجان وروبي ديساي ومايك يانغ. ونحن من مختبر كريس تشن هنا في جامعة بنسلفانيا. سنقدم في هذا الفيديو نهجنا لقياس قوى التجاذب الخلوي باستخدام مصفوفة أعمدة مصنعة مجهرياً.

تتولد قوى الشد من خلال التفاعلات بين الميوسين والأكتين وتلعب دوراً هاماً في وظائفنا الفسيولوجية. فأثناء عملية النمو، تُمكّن هذه القوى الخلايا من الانتقال من موقع إلى آخر من أجل تكوين البنى الأولية لأنسجتنا. كما أنها تساعد أيضاً في عملية الالتئام لأنها ضرورية لإغلاق الجروح أو لهجرة وزحف الكريات البيضاء عبر الجسم.

ولكن لسوء الحظ، يمكن أن تكون هذه القوى نفسها ضارة بصحتنا في حالة نقائل السرطان أو النمو الوعائي نحو الورم. لذا، تتوفر طرق قليلة جداً يمكن من خلالها قياس قوى الشد هذه بطريقة كمية، خاصة على المقياس الميكروي والنانوي للخلايا الفردية. كانت معظم الطرق الشائعة لدراسة الخلايا في المختبر تعتمد على أطباق ذات قاع زجاجي أو أطباق البوليستيرين، إلا أن هذه الركائز صلبة للغاية، وهي لا تسمح لنا بقياس قوى الشد والتشوهات التي تسببها الخلية فعلياً من الناحية الفيزيائية.

وبناءً على ذلك، كان من الصعب للغاية فهم الآليات الكامنة وراء قوى السحب دون وجود نوع من القراءات الفيزيائية. لذا، نستخدم في مختبر كريس تشين تقنية تتيح لنا التغلب على هذه القيود. تعتمد طريقتنا على مصفوفة رأسية من العوارض المرنة، والتي تم تصميم صلابتها ومقياس حجمها بحيث تنتشر الخلايا الفردية عبر عدة عوارض وتؤدي إلى ثنيها أثناء هذه العملية.

الأبعاد التي نستخدمها بشكل متكرر هي أعمدة أسطوانية بقطر 3 µm وارتفاع 10 µm، مع مسافة 9 µm من المركز إلى المركز في مصفوفة مستطيلة. ومع ذلك، يمكن تغيير هذه الأبعاد لتلائم مجموعة متنوعة من الدراسات الخلوية. نبدأ بقالب سيليكون صلب كما تظهرونه هنا، ومن ثم نقوم بتحويلها إلى عوارض PDMS مرنة كما نراها هنا.

باستخدام هذه التقنية، يمكننا قياس انحرافات الروافع الفردية تحت المجهر واستنتاج قوى الشد الخلوية من حيث المقدار والاتجاه اللازمين لتوليد مثل هذه الانحرافات. لقد حولنا هذه الركائز إلى وسادات M لكاشفات مصفوفات الأعمدة الدقيقة، وسنوضح لكم في هذا الفيديو كيفية تصنيع وسادات M، بدءاً من القالب السيليكوني مروراً بنسخ PDMS، وصولاً في النهاية إلى حساب التعديل والتقلص الخلوي. مرحباً بكم، نحن الآن في الغرفة النظيفة بمختبراتنا.

هذه غرفة خالية من الغبار وحساسة للضوء تتيح لنا تصنيع أعمدة SU eight التي ستعمل كقالب سيليكوني أساسي. سنبدأ أولاً بويفر سيليكون، ونقوم بتغطيته بمادة SU eight المقاومة للضوء؛ حيث إن SU eight عبارة عن مقاوم سلبي وحساس للضوء. لذا، عندما نسلط الضوء عبر هذا القناع الضوئي، سيؤدي ذلك إلى تشكيل نمط من الأعمدة الدقيقة، ومن ثم تكوين بنية ثلاثية الأبعاد، والتي ستكون هي أعمدة SU eight التي نقوم بعدها بصب PDMS حولها.

بعد الانتهاء من جميع عمليات المعالجة، سيبدو الرقاقة بهذا الشكل، حيث تكون هياكل الأعمدة المجهرية (micro pillar) والركائز المجهرية (micro post) قد صُنعت بالفعل في الرقاقة. ولصنع القوالب الرئيسية، نبدأ أولاً برقاقة سيليكون عارية، تم تنظيفها باستخدام معالجة الأوزون لمدة سبع دقائق، كما قمنا بتجفيف هذه الرقاقة لمدة 30 دقيقة عند 120 درجة Celsius. سنقوم بطلاء SU eight 2002 بطريقة التدوير لتشكيل طبقة قاعدة رقيقة جداً للركائز.

بما أننا سنقوم بتدوير SU eight، سأرتدي قناع الغاز، ثم أعيد تحميل الرقاقة في هذا الحامل هنا، وأزيل أي غبار قد يكون موجوداً عليها، ثم أضعها على جهاز التدوير، وسنتأكد من أنها تتوسط الجهاز. بعد ذلك، سنشرع في سكب SU eight 2002 فوقها. ثم سنقوم بتدوير الرقاقة. بعد ذلك نضعها على الصفيحة الساخنة لإجراء الخَبز اللين.

نكرر هذه العملية لمدة دقيقة واحدة بعد ذلك. ثم نأخذ العينة وننقلها إلى لوح تسخين بدرجة حرارة 95 درجة. ونستمر في ذلك لمدة دقيقتين.

وبمجرد الانتهاء من ذلك، سنأخذ العينة الآن ونقوم بإجراء التعريض الغمري في جهاز محاذاة القناع. حسنًا، لقد انتهينا للتو من غزل SU 8، وهي الطبقة الأولى من SU 8 على هذه الرقاقة، ونحتاج الآن إلى تعريض الرقاقة بأكملها غمرًا لإنشاء تلك الطبقة الأساسية الأولى للمنشآت الدقيقة. لذا، نحتاج إلى تعريضها بـ 70 millijoules.

لذا، نحتاج بعد ذلك إلى قياس الشدة الفعلية للضوء في جهاز محاذاة القناع هنا. لذا نقوم بوضع المقياس داخل جهاز محاذاة القناع، ثم نعرضه للضوء.

هذا هو ضوء UV هنا. نقوم بتحميل رقاقة السيليكون على جهاز محاذاة القناع، ونضعها داخل جهاز محاذاة القناع. ولأننا لا نستخدم قناعاً هذه المرة، فإننا بذلك نستطيع تعريض الغشاء بالكامل.

لنقم بتركيب الغالق، ثم نضبط وقت التعرض على دقيقة واحدة ونبدأ عملية التعريض. بعد مرور دقيقة واحدة واكتمال النظام، يمكننا إخراج الرقاقة. والآن نحتاج إلى إجراء عملية الخبز ما بعد التعريض.

لقد انتهينا للتو من تعريض هذه الرقاقة للأشعة، وسنقوم الآن بتسليط الحرارة لتحفيز تفاعل التشابك للطبقة الأولى من SU eight. لذا، نضعها على لوح تسخين بدرجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، ثم ننقلها إلى لوح تسخين بدرجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين. وبعد انتهاء عملية الدقيقتين، نقوم بإطفاء لوح التسخين ونترك الرقاقة لتبرد حتى تعود إلى درجة حرارة الغرفة، وهو أمر يستغرق حوالي 30 دقيقة.

لقد قمنا بصب الطبقة الثانية من SU8 على هذه الرقاقة. والآن نحتاج إلى تعريضها فعلياً من خلال القناع الضوئي. وفي هذه المرة، سنستخدم مرشح UV لحجب ذلك الضوء فوق البنفسجي العميق.

هذا زجاج بصري من نوع Hoya يمكن الحصول عليه، ولكننا نحتاج هذه المرة إلى قياس الشدة مرة أخرى. لذا سنستخدم مقياس الضوء الخاص بنا، أو سنستخدم المرشح الموجود في الأعلى لقياس الشدة التي تم ترشيحها. ومن ثم، سنقوم بتحميل القناع في جهاز محاذاة الأقنعة.

يقوم هذا المفتاح بتوليد فراغ يثبت القناع في مكانه. سنقوم بعد ذلك بوضعه في جهاز محاذاة القناع. ثم نضع المرشح في الأعلى ونقوم بتحميل الرقاقة.

نريد التأكد من وجود تلامس جيد، لذا نقوم برفعه لضمان التلامس ثم نبدأ عملية التعريض. وبعد انتهاء التعريض، سنقوم بإخراج الرقاقة من جهاز محاذاة القناع. وبذلك، أصبح لدينا مناطق تم تعريضها بشكل انتقائي. سننقل هذه الرقاقة إلى الفرن، أو إلى الصفائح الساخنة، لإجراء عملية الخبز ما بعد التعريض.

لقد انتهينا للتو من عملية الخبز النهائية بعد التعريض، وسنقوم الآن بتحميض هذه الرقاقة لنتمكن من الحصول على الهياكل ثلاثية الأبعاد. ما سنفعله هو غسل هذه الرقاقة وتحميضها في PGMEA، والذي سيعمل على إزالة مادة SU-8 غير المعرضة. لذا نبدأ أولاً بوضع الرقاقة في وعاء من PGMEA ونتركها فيه لمدة دقيقتين مع تحريك خفيف.

سأترك هذا لمدة دقيقتين. بعد ذلك، سنقوم بالنقل إلى طبق ثانٍ من P-G-M-E-A. سيؤدي ذلك إلى إزالة P-G-M-E-A المشبع بـ SU eight.

بعد مرور 10 ثوانٍ، سنقوم بنقله إلى الكحول الإيزوبروبيلي (IPA)، وذلك لغسل مادة P-G-M-E-A. نضعه هنا لمدة 20 ثانية، مع تحريك خفيف مرة أخرى.

والآن لدينا هياكل الأعمدة القائمة بذاتها. سنقوم بوضع هذه الهياكل في الهكسان، الذي يتميز بتوتر سطحي منخفض. سنقوم بالغسل لمدة خمس ثوانٍ في حمامين متتاليين من الهكسان، وبعد ذلك نصبح مستعدين لتجفيفها بالنفخ.

لقد انتهينا للتو من تحميض الرقاقة، وسنقوم الآن بوضعها على لوح تسخين ورفع درجة الحرارة تدريجياً حتى تصل إلى 150 درجة مئوية. وتعمل درجة الحرارة المرتفعة هذه على زيادة الربط التشابكي لـ SU eight لجعله أكثر صلابة من الناحية الهيكلية، وسنترك الرقاقة على لوح التسخين هذا طوال الليل، أي لمدة تتراوح بين 14 إلى 20 ساعة، وبعد ذلك سنقوم بإيقاف تشغيل لوح التسخين ونترك الرقاقة لتبرد حتى تعود إلى درجة حرارة الغرفة مرة أخرى.

لذا، ما نحتاج إلى القيام به هو تقطيع هذه الرقاقة إلى حجم أصغر. نريد أساساً قطع رقاقة السيليكون هذه لإنشاء شريحة صغيرة تحتوي فقط على هذا النمط الداخلي هنا. وسيبدو الأمر شبيهاً بهذا الهيكل هناك حيث سيتم استخدام الإيبوكسي.

وسنقوم بلصق هذه الشريحة على شريحة زجاجية بهذا الشكل، مما يوفر دعماً هيكلياً. أما بالنسبة لتقطيع الرقاقة، فهو أمر يشبه الفن إلى حد ما، ولكن ما يمكنك فعله هو استخدام قلم خدش ماسي والبدء من حافة واحدة فقط.

ونظراً لوجود المستويات البلورية، يتم عمل حز صغير؛ حيث يؤدي ذلك إلى إحداث كسر، يمكنني بعدها النقر عليه باستخدام هذه الأداة. يمكننا تقشير هذا الجزء، ومن ثم إجراء المزيد من القطوع هنا حتى نحصل على بنية صغيرة كهذه. بعد ذلك، يتم وضع شريحة السيليكون بسرعة على الزجاج وتثبيتها في مكانها، ثم تُترك لتستقر.

وبعد الانتهاء، سيكون لديك جهاز مشابه لهذا. لقد قمنا بتثبيت القالب السيليكوني على هذه الشريحة الزجاجية، وسنقوم الآن بطلائه بمادة floy، والتي ستساعد في تحرير هذا الهيكل من الـ PDMS لاحقاً. لذا، سنضع الشريحة داخل هذا المجفف، ثم سنأخذ بضع قطرات من الـ tri Chloro Siling ونضعها في المجفف.

نقوم بذلك داخل خزانة استخلاص الغازات لأن هذه العملية ينتج عنها غاز كلوريد الهيدروجين كمنتج ثانوي، وهو غاز حاد للغاية. قم الآن بإغلاق الغطاء، ثم صله بجهاز التفريغ، وبعد ذلك نترك العينة تحت تأثير التفريغ ونسمح بعملية الترسيب طوال الليل للحصول على طبقة تغطية جيدة فوق رقاقة السيليكون بأكملها. مرحبًا، أنا ويسلي ليجان.

أنا طالب دراسات عليا في مختبر كريستوفر تشن. في هذه المرحلة، قد شرح لك نيت كيف تقوم بإنشاء قالب سيليكوني أساسي لركائز ED الخاصة بنا. ومع ذلك، قبل أن نتمكن من استخدام هذه الأداة لقياس التقلص الخلوي، من الضروري أولاً تكرار الهياكل الضوئية الصلبة باستخدام بوليمر سيليكوني مرن.

تتمثل مهمتنا الأولى في إنشاء قالب سلبي من النموذج الرئيسي السيليكوني الذي قمنا بتصنيعه سابقاً. ونقوم بذلك باستخدام مطاط السيليكون المسمى PDMS أو بولي ميثيل سيلوكسان. نقوم الآن بإضافة عامل معالجة بنسبة 1 إلى 10 إلى بوليمر PDMS.

بمجرد وزن المحلول، من الضروري خلط بوليمر PDMS وعامل التشبيك جيداً. ومن الواضح أن عملية الخلط هذه تُدخل الكثير من فقاعات الهواء إلى المحلول؛ لذا، فمن الضروري في هذه المرحلة تغطيته وإزالة الغازات منه باستخدام المجفف بالتفريغ.

بمجرد تفريغ PDMS تمامًا من الغازات وصعود جميع الفقاعات إلى السطح وانفجارها، يمكننا إخراجه من المجفف بالتفريغ. يمكننا الآن استخدام هذا الخليط من PDMS وعامل الربط التشابكي لإنشاء قالب سلبي من القالب السيليكوني الأساسي. وللقيام بذلك، نستخدم وعاءً من القصدير ونضع القالب السيليكوني الأساسي المثبت في مركزه.

بعد ذلك، نسكب محلول بوليمر DGAs بعناية في الطبق فوق رقاقة السيليكون، مع محاولة منع تكون أي فقاعات إضافية. وعادةً ما نحاول سكب البوليمر بسماكة تبلغ حوالي ربع بوصة تقريباً. ويمكن ملاحظة أن هذه العملية تؤدي حتماً إلى إدخال القليل من فقاعات الهواء في الخليط.

والآن، نترك هذا الطبق جانباً لمدة 30 دقيقة تقريباً للسماح للفقاعات بالصعود إلى السطح والانفجار. يمكننا أن نرى أنه بعد تركها لفترة، لا تزال هناك بعض فقاعات الهواء على سطح الـ PDMS. ومع ذلك، ولأن هذه الفقاعات موجودة على السطح العلوي، يمكننا الآن استخدام دفعة سريعة من النيتروجين لتفجير أي فقاعات متبقية.

من أجل إتمام عملية الربط التشعبي لمحلول PDMS وCROSSLINKER وتوليد قالب سلبي صلب للماستر السيليكوني، نقوم بخبزه عند 110 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ونلاحظ وجود طبقة رقيقة من PDMS فوق ركيزة السيليكون. وقبل أن نتمكن من فصلهما عن بعضهما، من الضروري أولاً قطع هذه الطبقة.

بعد ذلك، يمكننا تطعيم هذه الطبقة العلوية وتقشيرها برفق بعيداً عن الركيزة السيليكونية. وفي هذه المرحلة، يمكننا قلب ركيزة السيليكون السالبة، أي ركيزة PDMS السالبة، وتقشيرها ببطء شديد بعيداً عن القالب السيليكوني. حسناً، نقوم بذلك عن طريق تثبيت أحد الطرفين والتقشير اللطيف لركيزة PDMS بعيداً.

يمكنكم ملاحظة تقدم الجبهة مع انفصال الركيزة عن القالب السيليكوني الرئيسي. والآن بعد أن قمنا بتكوين قالب سلبي من PDMS للقالب السيليكوني الرئيسي، يمكننا قطعه إلى أربعة قوالب سلبية فردية لصنع ركائز الوسادات النهائية. ومن المهم في هذه المرحلة عدم لمس الجزء العلوي من الركيزة السلبية بالملقط أو القفازات لتجنب إتلاف السطح.

في هذه المرحلة، قمنا بتوليد أربعة قوالب سلبية فردية من القالب الرئيسي السيليكوني المكون من آبار بقطر 3 µm وعمق 9 µm. ومن أجل استعادة أسطح الكابول البارزة، يمكننا الصب مرة أخرى على هذه القوالب السلبية باستخدام PDMS من شركة PDI. ومع ذلك، قبل القيام بذلك، من الضروري أولاً جعل هذه القوالب السلبية غير لاصقة عن طريق طلائها بفلورو.

نقوم بذلك في غرفة بلازما بقدرة مائة وات وبكامل طاقتها لمدة دقيقة واحدة. وبعد السماح للغرفة بالتفريغ ثم إعادة تشغيل البلازما، يتولد مجال غاز أيوني يقوم بنقش السطح العلوي لـ PDMS ويجعله أكثر التصاقاً بجزيئات fluoro Cy Lane. وبعد إزالة القوالب السالبة من جهاز التجفيف بالتفريغ، يمكننا أن نرى هنا أن ما تبقى لدينا هو مصفوفة من الآبار بعمق 3 ميكرون في 10 ميكرون في طبقة PDMS غير لاصقة.

من أجل إعادة إنتاج الكابوليات الرأسية (vertical cantilevers)، والتي نستخدمها في ركائز mpad، من الضروري إجراء عملية صب مرة أخرى باستخدام نفس خليط PDMS، مما سيوفر لنا مصفوفة قائمة بذاتها وإيجابية من الكابوليات المطاطية، والتي تعكس تماماً القالب السيليكوني الذي صنعناه سابقاً. الخطوة الأولى في هذا الإجراء هي نقل القوالب السلبية غير اللاصقة إلى مثبت تثبيت قمنا بصنعه من شرائح PDMS وشريحة مجهر زجاجية. وسيصبح السبب من استخدام هذا المثبت واضحاً في الخطوة التالية.

في هذه المرحلة، يمكننا وضع قطرة صغيرة من نفس خليط الـ PDMS والـ crosslinker بنسبة 10 إلى 1، والتي تم تفريغ الهواء منها مسبقاً، على السطح العلوي لكل قالب من القوالب السالبة. نحتاج فقط إلى كمية صغيرة من الـ PDMS لضمان عدم سيلانها على حواف القوالب السالبة. في هذه المرحلة.

من أجل توزيع الـ PDMS بشكل أكثر شمولاً عبر السطح العلوي للقوالب، يمكننا إمساك قالب واحد باستخدام الملقط، وقلبه، وملامسته بالقالب المجاور مع توزيع الـ PDMS بعناية لضمان تغطية الركيزة بأكملها تماماً. يجب توخي الحذر الشديد في هذه الخطوة لتجنب إدخال المزيد من الفقاعات في محلول الـ PDMS العلوي، ثم يمكن تكرار العملية مع القالبين الآخرين. والآن، وبعد الحصول على طبقة تغطية أكثر تجانساً من الـ PDMS عبر السطح العلوي، يمكننا وضع هذه الأداة في مجفف تفريغ (vacuum desiccator) لإزالة أي فقاعات قد تكون محتجزة داخل غشاء الـ PDMS الموجود فوق القوالب السالبة.

تستغرق هذه العملية عادةً حوالي 30 دقيقة. وبينما تخضع قوالبنا السالبة لعملية إزالة الغازات، يمكننا تنظيف الركائز الزجاجية مقاس 22 by 22 millimeter، والتي ستكون مكان التثبيت النهائي للوسادات. وتتمثل الخطوة الأولى في هذه العملية في إزالة أي جزيئات غبار باستخدام النيتروجين المضغوط.

سنعرض شرائح الغطاء الزجاجية لبلازما الغاز، والتي ستعمل على تفحيم السطح وجعله أكثر التصاقاً بـ PMS، والذي سنقوم بلصقه في الخطوة التالية. بعد ترك الطبقة العلوية من PDMS لتجف في الهواء (DGAs) لمدة 30 دقيقة تقريباً وتنشيط شرائح الغطاء الزجاجية بالبلازما، يمكننا بعد ذلك إزالة القالب الخاص بنا وجعل السطح العلوي لشرائح الغطاء الزجاجية، الذي تعرض لبلازما الغاز، يتلامس مع طبقة PDMS الموجودة فوق القوالب السالبة. وعادةً ما يكون من المفيد ملامسة إحدى حواف شريحة الغطاء الزجاجية مع PDMS أولاً، ثم السماح لبقية شريحة الغطاء الزجاجية بالاستقرار ببطء بحيث يتمدد PDMS على شكل ورقة.

يساعد ذلك في تقليل أي فقاعات قد تتكون في غشاء PDMS. وفي هذه المرحلة، يمكننا الضغط برفق على السطح العلوي لشريحة الغطاء الزجاجية باستخدام الملقط لدفع أي فائض من PDMS للخارج، وكذلك دفع شريحة الغطاء لتستقر مقابل صليب PDMS في مركز القالب. سيمنع ذلك شريحة الغطاء من التحرك أثناء تصلب PDMS.

نكرر هذه العملية بالنسبة للركائز الأخرى. في هذه المرحلة، يمكننا نقل القالب بأكمله إلى الفرن والخبز عند 110 °C لمدة 22 ساعة. وبعد ترك المجموعة بأكملها تبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة، يمكننا حينئذٍ إزالة الركائز وقلبها، ثم تقشير القالب السلبي بعناية عن شريحة الغطاء الزجاجية.

من المهم القيام بذلك ببطء وبشكل منتظم لتجنب سحق الأعمدة أو تمزيقها من الركيزة الزجاجية. يمكننا أن نرى أنه بعد إزالة القالب السلبي، تتبقى لدينا مصفوفة من الروافع التي تحاكي بدقة القالب السيليكوني الأساسي، ولكنها الآن مصنوعة من بوليمر PDMS المرن. حسنًا، لقد استعرضنا في هذه المرحلة كيفية إنتاج القالب السيليكوني الأساسي لركائز Emad الخاصة بنا.

بعد ذلك، استخدمنا عملية صب النسخ لإنتاج نسخة مطابقة تماماً باستخدام بوليمر مرن من نوع A-P-D-M-S، بحيث تصبح الروافد الآن مرنة للسماح للخلية بالانتشار والتقلص وتحريف الروافد خلال هذه العملية. وفي هذه المرحلة، تكون الركائز جاهزة للمعالجة من أجل زراعة الخلايا. والآن، بعد أن رأينا كيفية تصنيع ونسخ القوالب لصنع الـ eds، سنقوم ببعض الخطوات الإضافية لجعل الـ EDS وظيفية بحيث يمكننا زراعة الخلايا ومن ثم تحليل قوى الشد.

ولكن قبل القيام بذلك، نحتاج إلى تنفيذ ثلاثة أمور. نحتاج أولاً إلى جعل رؤوس الأعمدة لاصقة للخلايا. ثانياً، نحتاج إلى وسم الـ PDMS فلورياً للمساعدة في تصور وتحليل انحرافات الأعمدة.

وثالثاً، نحتاج إلى جعل الجدران الجانبية للأعمدة بالإضافة إلى قاعدة الأعمدة غير لاصقة للخلايا بحيث يتم تسليط قوى الشد عند أطراف الأعمدة فقط. لذا سنرى كيف تتقدم هذه الخطوات عبر استراتيجية تعتمد على الطباعة بالتلامس الدقيق في الدقائق التالية. ولكن أولاً، الخطوة التالية هي تنظيف فائض PDMS من الحواف.

وكما ذكرت، تتمثل الخطوة الأولى في أخذ ركيزة EDS، والتي عرض لك "ويست" للتو كيفية إنتاجها وتشذيبها. يتم التخلص من فائض PDMS الناتج عن معالجة شريحة الغطاء الزجاجية مقابل القالب السالب باستخدام شفرة حلاقة حادة. ولإزالة فائض PDMS، قم بوضع شفرة الحلاقة عمودياً على الركيزة عند حافة الأعمدة ثم ابدأ بالكشط.

ويمكنك استخدام إصبع واحد لتثبيت غطاء الشريحة في مكانه لضمان عدم تحركه. وبذلك، نحصل في النهاية على ركيزة M pad تم تنظيفها من الشوائب وأصبحت سهلة الوصول. وفي الخطوة التالية، يتعين علينا إجراء الطباعة بالتلامس الدقيق لـ MPAs لجعل رؤوس الأعمدة لاصقة.

للقيام بذلك، نحتاج أولاً إلى تصنيع القوالب، وهذه العملية سهلة للغاية. نقوم ببساطة بخلط PDMS بنسبة 1 إلى 30 بدلاً من نسبة 10 إلى 1. ثم نصب الخليط في طبق بتري بحيث يكون ارتفاع PDMS حوالي 1 cm.

اتركه ليتحلل من الغازات، أي اسمح للفقاعات بالصعود إلى سطح الـ PDMS، ثم قم بإتمام تفاعل التشبيك في الفرن عند 60 درجة لمدة ساعة واحدة. بعد إخراج الطبق من الفرن وتركه ليبرد، سأكون جاهزاً الآن لقص الأختام. ومرة أخرى، وباستخدام نفس النوع من شفرات الحلاقة، قم بالقص ببساطة عن طريق الضغط رأسياً إلى الأسفل داخل الـ PDMS حتى تلامس قاع طبق بتري.

الآن، يجب علينا الاهتمام بتوجه الختم. سيكون سطح الختم هو جانب الـ PDMS الذي تم صبه مقابل قاع طبق بتري لضمان بقائه مسطحاً. لذا، في هذه المربعة الكبيرة من الـ PDMS التي قمت بقصها، يكون سطح الختم الآن موجهاً للأعلى.

إن هذا الختم الآن أكبر بكثير من وسادات M، لذا سأقوم بتقليصه ليعود إلى حجم وسادة M واحدة عن طريق القص بشفرة الحلاقة، ونظرًا لصعوبة تحديد الاتجاه الصحيح للختم بالعين المجردة، سأقوم بعمل ثلم صغير في ما سيكون الجانب الخلفي للختم، وهو الجانب غير المواجه، على هذا النحو. ومن ثم يمكنني إزالة الختم من اللوح الأكبر. والآن لدي ختم A-P-D-M-S للخطوة التالية.

نريد تنظيف أختام PDMS. نظرًا لاحتمالية ترسب الغبار من الجو على أختام PDMS أثناء عملية قصها. تتضمن هذه العملية وضع العدد المطلوب من أختام PDMS في طبق التبلور هذا وملء طبق التبلور بـ 100% ethanol.

لذا، قم فقط بإضافة كمية كافية من الإيثانول لتغطية سطح الأختام، علماً بأن الكمية الدقيقة للإيثانول المضاف ليست مهمة. ثم ضع قرص التبلور في جهاز السونيكيتور وقم بمعالجة الأختام بالموجات فوق الصوتية لمدة خمس دقائق. وبعد انتهاء الدقائق الخمس، سننتهي من تعقيم الأختام ونقوم بتنفيذ بقية عملية الطباعة بالتلامس الدقيق، وهي وظيفية وسادات M، داخل غطاء زراعة الأنسجة المعقم.

نحن الآن في كبينة زراعة الأنسجة حيث يمكننا إتمام عملية تعقيم القوالب. وللقيام بذلك، نأخذ القوالب من طبق التبلور، ونغمسها في طبق مملوء بالإيثانول لشطف أي بقايا عالقة، ثم نغمسها أخيراً في طبق من الماء لشطف الإيثانول. بعد ذلك، نقوم بتجفيف القوالب باستخدام تيار من النيتروجين حتى لا تبقى أي قطرات مرئية.

في الخطوة التالية، يجب تحبير الأختام باستخدام محلول بروتيني. محلول البروتين المستخدم هو 50 µg/mL من الفبرين في ماء DEI. ببساطة، اسحب كمية من المحلول البروتيني بواسطة الماصة، ثم ضع قطرات من المحلول البروتيني على وجه الختم.

يمكنك القيام بذلك عن طريق وضع قطيرات صغيرة على حافة وجه الختم. أولاً، كرر هذه الخطوة لجميع الأختام التي ستستخدمها، وكان ينبغي القيام بذلك مسبقاً. لذا، فإن الخطوة التالية بعد وضع النقاط على حواف جميع الأختام هي ربط تلك القطيرات وملء محلول البروتين على وجه الختم.

لقد قمنا بذلك لأن محلول البروتين في القطيرات يمتص في السطح الموجود أسفل القطيرات ويجعل سطح الختم محبًا للماء، مما يسهل نشر بروتين المصفوفة خارج الخلية. لذا، كرر هذه العملية لجميع الأختام المستخدمة. والآن بعد أن قمنا بنشر محلول البروتين على وجه الأختام، فإن الخطوة الأخيرة في تحبير الأختام هي التأكد من تغطية الحواف. وللقيام بذلك، نقوم ببساطة بإمالة الماصة وتمريرها على طول وجه الختم بحيث تلامس كلاً من زاوية ختم PDMS ومحلول البروتين.

وكرر هذه العملية مجدداً لجميع حواف كافة الأختام التي يتم تحبيرها. وبعد الانتهاء من تحبير الأختام، نقوم بوضعها وتركها داخل غطاء زراعة الأنسجة لمدة ساعة واحدة لتسهيل الامتصاص الكامل للبروتين على وجه الختم. والآن، بعد انتظار لمدة ساعة ليمتص السطح البروتينات، حان الوقت لشطفها بالماء وتجفيفها باستخدام النيتروجين.

للقيام بذلك، نأخذ ماءً معقماً ونصبه في الطبق الذي يحتوي على الأختام. يجب الحذر من صب الماء مباشرة على وجه الختم، ويمكن استخدام الماصة إذا لزم الأمر. لا تهم كمية الماء الدقيقة المستخدمة، طالما أن مستوى الماء يرتفع فوق محلول البروتين.

بعد ذلك، وباستخدام ملقط معقم، خُذ ختماً واحداً واغمره في طبق جديد من الماء، ثم جففه برفق عن طريق النفخ بالنيتروجين. وستعرف أنه قد جف عندما لا تعود ترى قطيرات من محلول البروتين على الختم. كرر هذه العملية لجميع الأختام التي تعالجها واحداً تلو الآخر.

والآن بعد أن قمنا بتجفيف الأختام عن طريق الشطف، حان الوقت لتنشيط ركائز mpad من خلال معالجتها بالأوزون والأشعة فوق البنفسجية (UV ozone). لمدة سبع دقائق، أقوم بإزالة غطاء طبق بيتري من الأعلى. ونظرًا لأن البوليسترين يمتص الأشعة فوق البنفسجية، أضع الطبق في جهاز المعالجة بالأوزون والأشعة فوق البنفسجية، ثم أغلق الدرج، وأضبط الوقت على سبع دقائق، وأبدأ التشغيل.

نعود الآن إلى غطاء زراعة الأنسجة وحان الوقت لختم ركائز mpad التي عولجت للتو بالأوزون والأشعة فوق البنفسجية. وللقيام بذلك، ارفع الأختام التي تم شطفها وتجفيفها باستخدام الملقط. يمكنك إمساك الأختام من الجوانب، ولكن تجنب لمس وجه الختم.

يجب ضبط الختم في الملقط بحيث يكون جانب البروتين متاحاً. ثم قم بقلب الملقط، مع مراعاة أن يكون جانب البروتين متجهاً للأسفل، وأنزِل الختم ببطء ليتلامس مع الـ eds. تكون الأختام من 1 إلى 30 لزجة للغاية، لذا قد تضطر إلى استخدام زوج ثانٍ من الملاقط لتحرير الختم من الملقط.

يمكنك إسقاط الختم من ارتفاع يتراوح بين 2 مليمتر و8 مليمتر تقريباً فوق الـ emeds. بعد ذلك، قم بإمالة طبق الـ emeds للأعلى واضغط برفق باستخدام الملاقط لإحداث تلامس بين الختم والـ eds. ستعرف حدوث التلامس بإحدى طريقتين.

الطريقة الأولى هي فحص سطح ED من خلال جانب الختم. قد يكون من الصعب رؤية ذلك عبر الكاميرا، ولكن يمكنني بالعين المجردة أن أرى بوضوح أن الختم يتلامس مع السطح عند النظر إلى السطح من خلال جانب الختم. أما الطريقة الثانية لضمان التلامس، فهي إخراج طبق Petri من غطاء زراعة الأنسجة مع إبقاء الغطاء مغلقاً وفحصه تحت مجهر مقلوب.

من خلال معاينة أنماط التداخل باستخدام المجهر، يجب أن تكون قادرًا على تحديد ما إذا كان الختم في حالة تلامس مع ركيزة الـ eds وتوقيت ذلك. وبمجرد التأكد من حدوث التلامس، يكفي أن يظل الختم متلامسًا مع ركيزة الـ ed لبضع ثوانٍ؛ لذا حان الوقت الآن لإزالة الختم.

للقيام بذلك، قم بطي الحواف للأسفل باستخدام ملقط واحد وبحركة واحدة سلسة، قم بإزالة الختم. تأكد من تتبع الحواف التي قمت بختمها والأختام التي استخدمتها مسبقاً. وكرر هذا الإجراء مرة واحدة لكل EMPAs لكل ركيزة ترغب في استخدامها.

بعد أن انتهينا من ختم الـ EMPAs، الخطوة التالية هي تعقيمها ثم تحضينها في صبغة محبة للدهون تسمى dye eye. صبغة Dai هي جزيء محب للدهون مُوسوم بفلورة، لذا فهي تنتشر داخل الـ PDMS على مدار فترة زمنية تسمح لنا بتصور انحرافات الأعمدة تحت المجهر. لذا، سأقوم بأخذ كل ركيزة empa بشكل فردي واحدة تلو الأخرى وغمرها في 100%ethanol، ثم 70%ethanol، ثم DI water، ثم DI water، ثم DI water، ثم DI water.

وأخيرًا، محلول من dii بتركيز 5 µg/ml. وبما أن محلول DII فلوري، فمن أجل تقليل تعرضه للضوء المحيط والحد من التبييض الضوئي، نقوم بتغطية الأطباق بورق الألمنيوم أثناء تحضينها في غطاء زراعة الأنسجة لمدة ساعة واحدة. والآن، بعد أن انتظرنا ساعة كاملة لتحضين وسادات EM في محلول DAI، يمكننا إزالة ورق الألمنيوم وشطف محلول DAI.

نقوم بشطفها عن طريق غمرها ثلاث مرات متتالية في ماء معقم، وأخيراً، نغمرها في محلول من 0.2%onic F1 27. وهذا يعادل 0.2% وزن/حجم. ومن المهم خلال جميع خطوات الغمر تقليل الوقت الذي تتعرض فيه منصات EM للهواء؛ وذلك لمنع تلف ركائز ED، وبشكل خاص لمنع انهيار العمودين على بعضهما البعض.

إن F1 27 بتركيز 0.2% هو بوليمر إسهامي ثلاثي الكتل يتكون من نطاقات محبة للماء ونطاقات كارهة للماء. ومن المعروف أن النطاق المحب للماء يقاوم امتصاص البروتين وبالتالي يمنع التصاق الخلايا، بينما يرتبط النطاق الكاره للماء بـ PDMS الكاره للماء. وبناءً على ذلك، عندما يتم غمر PDMS في F1 27، يرتبط F1 27 بـ PDMS ويعمل على طرد التصاق الخلايا.

بعد تحضين لمدة ساعة واحدة في F1 27 المزمن داخل طبق بتري مغطى بورق ألومنيوم، يمكننا شطف F1 27 عن طريق الغمر المتتالي في ماء معقم، ثم ماء معقم، ثم PBS. بعد الغمر في PBS وشطف منتج F1 27، يمكننا بعد ذلك غمر الركائز eds في محلول استنبات الخلايا المختار. يمكن أن يحتوي محلول استنبات الخلايا الذي غمرت فيه EMPAs للتو على مصل و/أو عوامل نمو أخرى و/أو مكملات مثل البنسلين والستريبتومايسين.

تتوافق جميع هذه المكونات تماماً مع معالجات EMPAs. الخطوة التالية، بمجرد غمر الـ eds في محلول استنبات الخلايا، هي استزراع الخلايا المختارة على الـ eds. وفي هذا الإعداد التجريبي تحديداً، سأقوم باستزراع خلايا بطانية من الشريان الأبهر الرئوي البقري في ثلاثة أطباق مختلفة.

يعود السبب في استخدامي لثلاث أطباق مختلفة إلى أنني سأعالج اثنين من هذه الأطباق بمثبطات ملمس معروفة لتثبيط انحرافات القوائم، حيث سنتمكن من إجراء المقايسة في وقت لاحق. ولزراعة الخلايا، أقوم ببساطة بأخذ معلق الخلايا، وسحب الكمية المناسبة باستخدام الماصة، ثم إضافتها قطرة بقطرة في كل طبق. وأضيف عدداً كافياً من الخلايا بحيث تكون موجودة كخلايا مفردة على الأطباق عند إجراء مقايسة قياس قوى السحب.

تعتمد الكمية التي ستضيفها على مساحة الانتشار ومعدل نمو الخلايا المحددة التي تستخدمها. عادةً ما نقوم باستزراع ما بين 1500 و 5,000 خلية لكل سنتيمتر مربع من الركيزة. بعد الانتهاء من استزراع الخلايا أو إضافة معلق الخلايا قطرة بقطرة إلى المزرعة، قم بهز المزرعة بلطف ذهاباً وإياباً عدة مرات في اتجاهات متعامدة لخلط معلق الخلايا داخل طبق الزرع.

كرر هذه العملية لجميع الركائز المستخدمة. فور زراعة الخلايا، ضعها في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C مع مستوى مناسب من ثاني أكسيد الكربون لضبط pH وأوساط زراعة الخلايا. بعد مرور ساعتين تقريباً من زراعة الخلايا، يفضل شطف الخلايا عن طريق نقل الركائز من طبق يحتوي على الوسط إلى طبق جديد يحتوي على نفس وسط زراعة الخلايا.

السبب في إجراء عملية الشطف هذه هو أن معظم الخلايا ستكون قد بدأت في الانتشار ووصلت تقريباً إلى مساحة انتشارها النهائية بحلول الساعتين. ومن خلال شطف الخلايا والركائز، فإنك تقوم بإزالة أي خلايا عائمة من وسط استزراع الخلايا. وبهذه الطريقة، ستظهر فقط الخلايا التي التصقت بـ EDS وبدأت في عملية الانتشار في المقايسة النهائية لقياس قوى السحب.

أحد الاختبارات التي يمكننا إجراؤها باستخدام الخلايا التي تمت زراعتها على MPAs هو التصوير بفاصل زمني لفحص ديناميكيات التقلص الخلوي كمياً. وعلى وجه الخصوص، تبرز أهمية دراسة ديناميكيات التقلص الخلوي استجابةً للعوامل الذائبة. ومن المعروف أن العوامل الذائبة، مثل المركبات البيولوجية والمركبات الاصطناعية، تؤدي إلى زيادة أو تقليل التقلص الخلوي، أو يكون لها تأثيرات غير معروفة عليه.

بالنسبة لهذه التجربة على الخلايا الحية، سنستخدم هذا المجهر الفلوري المقلوب. وعلى منصة المجهر، وضعتُ صندوق حاضنة صغير متصل بمنظم حراري للحفاظ على درجة الحرارة عند 37 °C مع 5% CO2. وسنقوم بالتصوير بتكبير عالٍ باستخدام عدسة شيئية 60 x plan APO.

سنقوم الآن بتجهيز ركيزة الاصطدام للتصوير. تبلغ مسافة العمل للعدسة الشيئية 60x التي نستخدمها في التصوير 200 ميكرون، وهي أقل بكثير من سمك طبق زراعة الأنسجة الذي زرعنا فيه الخلايا سابقاً. وبناءً على ذلك، لا يمكننا تصوير الخلايا الموجودة على الغرسات داخل طبق زراعة الأنسجة.

لتجاوز هذه المشكلة، نستخدم هذه الأطباق ذات القاع الزجاجي. سأقوم الآن بنقل الركيزة إلى الطبق ذو القاع الزجاجي بشكل مقلوب بحيث تكون الخلايا وأطراف الركائز عند الواجهة الفاصلة للطبق ذو القاع الزجاجي. وبذلك، عند وضع هذا الطبق على المجهر، ستكون مسافة العمل بين الخلايا والعدسة الشيئية أقل من 200 ميكرون.

نحن الآن مستعدون لوضع هذه العينة على المجهر للتصوير. سأقوم الآن بفتح غرفة حضانة الخلايا الحية، ووضع العينة بداخلها، ثم إغلاق غطاء غرفة الحضانة. وفي هذه المرحلة، سأقوم بفحص الركيزة للبحث عن خلية مناسبة.

للتصوير. الطريقة الأكثر فعالية للقيام بذلك هي استخدام عدسة شيئية بمكبر 10x من نوع face phase one، والتي ستسمح لي برؤية مجال أوسع من الركيزة والعثور على خلية بشكل أسرع. معاييري لاختيار خلية جيدة هي أن تكون خلية واحدة منفردة.

يجب ألا تكون الخلية ملامسة لأي خلايا مجاورة، كما يجب أن يكون حجمها متوسطاً مقارنة بجميع الخلايا الأخرى الموجودة على الركيزة؛ لقد وجدتُ خلية مناسبة للفحص. الخطوة التالية التي سأقوم بها هي تغيير العدسة الشيئية إلى 60x لفحص الخلية بتكبير عالٍ. وللقيام بذلك، نقوم بإلغاء تركيز العدسة الشيئية، وذلك لتجنب الاصطدام بالمنصة أثناء التدوير.

أثناء تدوير القرص، افتح الغرفة، وقم بتدوير العدسة الشيئية 60x جزئياً؛ حيث إن العدسة الشيئية 60x هي عدسة غمر زيتي، لذا يجب وضع قطرة من زيت الغمر على العدسة الشيئية. والآن سنكمل تدوير القرص لوضع العدسة 60x في الموضع الصحيح. سنقوم بإغلاق غرفة الحاضنة وإعادة ضبط بؤرة العدسة الشيئية لإعادة الخلية إلى نطاق التركيز.

بمجرد ضبط الموضع والتركيز البؤري للخلية بدقة، سأنتقل إلى كاميرا CCD لمعاينة الخلية على شاشة الكمبيوتر ومن ثم البدء في التصوير الفاصل الزمني. في هذه التجربة، سأقوم بجمع صور الطور والصور الفلورية على فترات زمنية مدتها دقيقة واحدة، وقد بدأ الآن التصوير الفاصل الزمني وسأتركه يعمل لمدة 10 دقائق أو 10 إطارات، وعند هذه النقطة سأضيف المصل. لقد مضت الآن 10 دقائق، وفي هذا الوقت، سأفتح الغرفة وأضيف المصل إلى الطبق لتحفيز القدرة الانقباضية في الخلية.

لا يزال الميقات يعمل، لذا يجب أن أكون سريعاً في القيام بذلك. الآن، سنواصل تصوير الخلية لمدة 30 دقيقة لمتابعة أي تغيرات في القدرة على الانقباض. بعد الانتهاء من التصوير بالفاصل الزمني، يمكن تسلسل الصور لتحويلها إلى مقطع فيديو كما هو موضح. إليكم مقطعان للفيديو يتضمنان صور الطور وصور الفلورة.

يظهر على اليسار مقطع فيديو بمجهر تباين الطور لخلية شفافة في الغالب ومحددة باللون الأسود. تنتشر الخلية فوق رؤوس 20 عموداً، وهي الهياكل الدائرية المرتبة في شبكة مستطيلة. ويظهر على اليمين مقطع فيديو فلوري لنفس الخلية، ولكن الأعمدة فقط هي المرئية.

عند تشغيل هذه المقاطع، ستلاحظون أن القوائم المتصلة بالخلية تكون ضعيفة في البداية، ومنحنية، وتنزاح قليلاً جداً عن الشبكة المستطيلة. وفي منتصف المقطع، قمت بإضافة المصل إلى الوسط الغذائي، حيث يحفز المصل الخلية على زيادة قدرتها على الانقباض.

بينما تبذل الخلية قوى سحب أكبر على الركائز الموجودة أسفلها، تبدأ الركائز الواقعة على محيط الخلية في الانحراف نحو الداخل. وفي المقطع الفلوري، ترى الآن الركائز تنحرف بشكل ملحوظ عن مواقعها في الشبكة المستطيلة. وكما سأوضح لاحقاً، يمكن استخدام إزاحة مواقع هذه الركائز في هذه الصور لتحليل قوى السحب لهذه الخلية.

لقد رأينا سابقاً كيفية تحضير ركائز mpad وكيفية وظيفيتها من أجل زراعة الخلايا. والآن ستلاحظون أنني وضعت ركائز mpad النهائية في ثلاثة أطباق زراعة خلايا مختلفة. لقد نمت الخلايا طوال الليل، وما سأقوم به الآن هو معالجة كل طبق زراعة خلايا على حدة بعامل ذواب مختلف يعمل على تعديل القدرة على التقلص بطريقة معروفة.

يمكننا بعد ذلك قياس قوى السحب الناتجة بطريقة كمية بعد تثبيت الخلايا لمدة 30 دقيقة. فبعد إضافة العوامل الذائبة بـ 30 دقيقة من إضافة مثبطات الانقباض، يحين الوقت الآن لتثبيت الخلايا باستخدام الـ paraformaldehyde لتجميد الحالة الراهنة لقوى السحب. وللقيام بذلك، من المهم استخدام paraformaldehyde يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم، ونستخدم paraformaldehyde بنسبة حجمية تبلغ 3.7%. إن طريقة غمر الركائز في الـ paraformaldehyde هي نفس طريقة غمر الركائز في الـ RINs المختلفة أثناء عملية الوظيفية.

بمعنى آخر، من المهم عدم السماح بجفاف الركائز لأن ذلك قد يؤدي إلى انهيار لاحق. بعد نقل الركائز، أتركها لتحضن في البارافورمالدهيد لمدة 20 دقيقة. وبانتهاء الـ 20 دقيقة، نقوم بإزالة الركائز من البارافورمالدهيد، والآن بعد أن تم تثبيت الخلايا، يمكننا معالجة هذه العينات لإجراء صبغ مناعي قياسي.

وللقيام بذلك، نضع الركائز بحيث يكون الوجه للأعلى على بارام، ثم نسحب بكمية كافية من PBS لتغطية الركيزة وإبقائها مغمورة فيه. بعد ذلك، نقوم بشطف الركيزة ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة أي بارافورمالدهيد قد يتبقى في المزرعة. وبعد شطف الركيزة ثلاث مرات بـ PBS، يمكننا نقل الركيزة لإجراء عملية الصبغ المناعي اللاحقة.

نقوم بذلك عن طريق التعامل مع الركيزة باستخدام ملقط وقلبها في الخطوة الأولى من التلوين المناعي، وهي استخدام عامل نفاذية. في هذه الحالة، نستخدم 0.2%Triton X في PBS. ومع ذلك، يمكن للمستخدم استخدام أي عامل نفاذية يكون الأكثر ملاءمة لاحتياجاته.

نكرر هذه العملية لجميع الركائز الخاصة بنا، وبهذه الطريقة يتم التعامل مع الركائز خلال عملية الصبغ المناعي. وبعد الصبغ المناعي، يتم تثبيت الركائز على شريحة زجاجية قياسية بمقاس بوصة واحدة في ثلاث بوصات، والتي يمكن بعد ذلك فحصها باستخدام أي مجهر فلوري انعكاسي (epi fluorescence microscope)، سواء كان مقلوباً أو قائماً. ومن خلال معالجة العينات باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope)، يمكننا التركيز على قاعدة القوائم للحصول على المواضع الصفرية غير المنحرفة.

يمكننا بعد ذلك تركيز العدسة على قمم القوائم، والتقاط صورة أخرى لها، ومن خلال مقارنة الصورة العلوية بالصورة السفلية، يمكننا قياس انحرافات القوائم وحساب قوى السحب التي ولدتها الخلايا لإحداث هذه الانحرافات. ومن خلال تطبيق هذه العملية على العديد من الخلايا المختلفة في عدة ظروف متنوعة، يمكننا حينئذٍ مقارنة قوى السحب المتولدة في الظروف المختلفة. والآن بعد أن جمعنا صوراً للخلايا الحية والمثبتة، فإن مهمتنا التالية هي قياس الانحراف، وقياس قوى السحب في الخلايا.

للقيام بذلك، قمنا بكتابة برنامج حاسوبي بلغة matlab. وهذه هي الصور الثلاث التي سنستخدمها في هذا التحليل. الصورة الأولى هي صورة طورية للخلية.

من المفيد استخدام ذلك لتحديد موقع الخلية. أما الصورة الثانية فهي صورة فلورية لقمم الأعمدة، ونستخدم هذه الصورة لتحديد مواقع الأعمدة عند أطرافها.

كما تلاحظون، فإن بعض هذه القوائم منحرفة وتنزاح عن الشبكة المستطيلة التي تقع فيها معظم القوائم، مثل هذه القائمة، وهذه القائمة. أما الصورة الثالثة التي سنستخدمها فهي الصورة الأساسية، والتي ترصد موقع القوائم عند مستوى بؤري يمر عبر قاعدتها.

عند هذا المستوى، يجب أن تكون القوائم، سواء كانت منحرفة أو غير منحرفة، في وضع السكون، أي في أوضاعها غير المنحرفة. في الشبكة المستطيلة، يمكنك ملاحظة أن القوائم التي كانت منحرفة عند قاعدتها في الصورة الثانية، تقع الآن في وضعها المسطح. تُستخدم هذه الصورة لتحديد موضع القائم في حالته غير المنحرفة.

بعد ذلك، نقوم بتشغيل برنامج MATLAB، والذي سيطلب منا تحميل هذه الصور الثلاث. قم بتسمية الملف. تظهر أمامك الآن صورة الطور.

سنقوم برسم مربع حول المنطقة التي توضح موقع الخلية، لكي يتمكن البرنامج من معرفة الأعمدة التي يجب تحليلها. بعد ذلك، يقوم البرنامج بإجراء معالجة للشدة، وتحديد العتبة، وتجزئة الصورة المقصوصة لتحديد إحداثيات OID للأعمدة. تظهر على اليسار الصور المجزأة للأعمدة من الصورة العلوية، بينما تظهر على اليمين الصور المجزأة لنفس الأعمدة من الصورة الأساسية.

بعد الحصول على الأعمدة وإحداثيات OID، يمكن للبرنامج بعد ذلك تحديد نواقل الإزاحة بين قمة وقاعدة كل عمود. ويمكن تحويل نواقل إزاحة هذه الأعمدة إلى نواقل قوة عن طريق ضربها في ثابت الزنبرك الخاص بالعمود. كما يمكننا تحليل هذه القوى الخلوية بعدة طرق، مثل متوسط القوة لكل خلية أو متوسط القوة لكل عمود.

تتمثل إحدى النتائج المفيدة في مخطط المتجهات (quiver plot) الذي يمكننا من خلاله تصور التوزيع المكاني للقوى. هذه هي الخلية التي قمنا بتحليلها للتو، ويمكنكم أن تروا أنني وضعت أسهمًا صفراء فوق الركائز، والتي ترتبط مقدارها بقيمة القوة وتشير إلى اتجاهها. ومن خلال تكرار عملية تحليل الصور هذه على تسلسلات من الصور، مثل تلك المطلوبة في فيلم التصوير الزمني (time lapse movie)، يمكننا إنشاء تسلسل زمني.

إليك مقطع فيديو للخلية التي قمنا بتحفيزها باستخدام المصل. وكما تلاحظ، بمجرد إضافة المصل، زادت قدرة الخلية على الانقباض وزاد انحراف الأعمدة بشكل أكبر. بالإضافة إلى ذلك، يمكننا قياس القوى لعدد أكبر من الخلايا التي خضعت لظروف مختلفة ثم تم تثبيتها وصبغها، كما هو موضح في مخططات الأسهم (quiver plots) هذه التي تعرض خلية عولجت بمركب ضابط مقابل خلايا عولجت بمثبطات الانقباض.

كما يمكنكم أن تروا، فإن متجهات القوة المؤثرة على الخلية في الحالة الضابطة تكون أطول في المقدار من متجهات القوة في الحالتين اللتين استُخدمت فيهما مثبطات التقلصية؛ لقد غطينا هنا مادة علمية واسعة لوصف الركيزة المجهرية، بدءاً من التصنيع الدقيق وصولاً إلى تحضير العينات، والتجارب والتحليل، وذلك لإثبات تعدد استخدامات هذه الركائز.

لقد وصفنا اختبارين مختلفين، وهما تصوير الخلايا الحية واختبار العينات المثبتة، وأجرينا تحليلاً للخلايا التي تم الحصول عليها من كلا هذين الاختبارين وعرضنا مخططات وأفلام المتجهات (quiver plots and quiver movies). وباستخدام هذه الأداة القوية، يمكن إجراء مجموعة متنوعة من التحليلات المكانية والزمانية لانقباض الخلايا. وكما رأيتم، اعتمدت هذه الطريقة على العديد من التخصصات المختلفة، بما في ذلك التصنيع الدقيق، وبيولوجيا الخلية الأساسية، وعلم الأسطح، وتحليل الصور ومعالجتها، وغيرها الكثير.

وبسبب استناد هذه الطريقة تحديداً إلى عدة تقنيات هندسية مختلفة، يمكن تخصيص المعلمات مثل هندسة الدعامة، والعوامل الذائبة المستحثة، وطرق تحليل انحرافات الدعامة وفقاً لاحتياجات المستخدم. ونأمل أن يكون العرض المرئي لهذه الطريقة، والذي استعرضناه خلال الـ 20 أو 30 دقيقة الماضية، بمثابة نقطة انطلاق لتحليلات أخرى وأكثر عمقاً في تنظيم القوى الجاذبة الخلوية وعواقبها الوظيفية وآلية تولدها.