A Chelex بروتوكول بسيط لاستخراج الحمض النووي من

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخلاص الحمض النووي (DNA) للملاريا والطفيليات والبعوض من أقسام المعي المتوسط والغدد اللعابية في عينات الشذوذ. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق قطع البعوضة بدقة عند المفصل الموجود بين البطن والصدر، وبذلك يتم فصل المعي المتوسط عن قسم الغدد اللعابية. بعد ذلك، يتم طحن كل قسم على حدة في ماء منزوع الأيونات.

بعد ذلك، يتم معالجة معلق الأنسجة بمحلول قلوي وغسله، ثم يتم استرجاع كتلة الخلايا. وفي النهاية، يتم إعادة تشكيل كتلة الخلايا وغليها، ومن ثم استخلاص الـ DNA. وفي الختام، يمكن الحصول على نتائج تظهر DNA عالي الجودة للبعوض وطفيليات الملاريا، يكون مناسباً للاستخدام كقالب لتحديد التشوهات، وأنواع النواقل، والنمط الجيني لإصابات الملاريا من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والهضم الإنزيمي المحدِّد للأليلات.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية البسيطة للغاية مقارنة بالتقنيات الحالية، مثل الاستخلاص العضوي وطرق الفرز، في أنها تستخدم عدداً قليلاً جداً من الكواشف الآمنة والمتوفرة بسهولة، كما أنها تتطلب وقتاً أقل بكثير للمعالجة. لبدء تشريح البعوضة، ضعها على قطعة صغيرة من البارافورم وثبتها تحت مجهر تشريحي، ثم غطِّها بقطرة من الماء منزوع الأيونات.

لتليين الأنسجة في الحجم، يتم قطع جثة البعوضة بدقة عند المفصل الموجود بين الصدر والبطن. وبذلك يتم فصل الرأس والصدر عن القسم البطني. يتم نقل كل قسم من أقسام البعوضة المشرحة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter معقم ونظيف، ومصنف مسبقاً برقم تعريف البعوضة والقسم الجسماني؛ تخلص من غشاء البارافيلم، وباستخدام منديل Kim wipe مبلل بـ 70% alcohol، امسح منصة المجهر بعناية قبل الانتقال إلى البعوضة التالية. لاستخراج DNA البعوضة، ابدأ بسحب 20 µL من الماء منزوع الأيونات باستخدام الماصة ووضعها في أنبوب العينة.

استخدم رأس الماصة لسحق مقطع البعوضة المغمور حتى يتكون معلق متجانس. أضف 100 µL من محلول XPBS 1% saponin المعقم بالأتوكلاف إلى متجانس العينة، ثم استخدم جهاز vortex بلطف للمزج. حضن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك، يتم إجراء عملية الطرد المركزي عند 20,000 G لمدة دقيقتين، ثم يتم التخلص من السائل الطافي. أعد تعليق الراسب في 100 µL من XPBS. ثم كرر عملية الطرد المركزي.

أضف 75 µL من الماء المقطر المعقم و 25 µL من معلق راتنج Cellex 100 بتركيز 20% weight per volume في الماء المقطر، ثم قم بالرج الخفيف باستخدام جهاز vortex لإعادة تعليق الراسب باستخدام إبرة تحت الجلد مقاس 23 gauge معقمة تم تعقيمها باللهب بواسطة موقد بنزن. اثقب ثقباً في غطاء أنبوب العينة.

يُغلى معلق العينة في كتلة تسخين لمدة 10 دقائق. ثم يتم إجراء عملية طرد مركزي عند 20,000 G لمدة دقيقة واحدة، وتُنقل محلول DNA إلى أنبوب تخزين مُصنف مسبقاً لاستخدامه كقالب في تفاعلات PCR للتحقق من جودة الـ DNA المستخلص، وتضخيم منطقة من جين nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit four الميتوكوندري الخاص بالمفصليات، والتي يُتوقع أن تنتج قطعة بطول 400 base pair. بعد ذلك، وللتمييز بين أنواع Ananais Gambia، يتم تضخيم منطقة تحيط بـ SNPs في منطقة الفاصل بين الجينات، والتي يُتوقع أن تنتج أحجاماً تبلغ 390 base pairs لنوع Ananais Gambia Sens Stricto، و315 base pairs لنوع ananais api.

يتم بعد ذلك إجراء التنميط الجيني لتعدد أشكال مقاومة عقاقير مضادات الفولات في طفيلي p falciparum. يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل (nested PCR) لتضخيم المنطقة المتاخمة للكودونات الأمينية 16 و51 و59 و108 و164. وفي جين ريدكتيز ثنائي الهيدروفولات (dihydro folate reductase) الخاص بالطفيليات، يتم إجراء هضم محدد للأليل للقطعة المضخمة للكشف عن مقاومة عقاقير مضادات الفولات.

تعدد الأشكال المرتبط. يتم فحص التفاعلات على هلام AROS بتركيز 2%. وتظهر أمثلة النتائج من فحوصات PCR لتقييم جودة مستخلص الحمض النووي للبعوض، وتحديد الهوية الجزيئية لـ RABIS، والنمط الجيني لـ p falciparum أن طريقة Kelex المبسطة تعطي نتائج مشابهة لبروتوكول التمليح القياسي (salting out)، وذلك على الرغم من وجود خطوات أقل واستغراق أقل من ربع الوقت مع جودة مماثلة للحمض النووي في المستخلصات المعنية؛ لذا ليس من المستغرب ألا تكون معدلات إيجابية العينات فيما يتعلق بالتشوهات، والأنواع الشقيقة في غامبيا، وكذلك معدلات الإصابة بالطفيليات مختلفة إحصائياً بناءً على اختبار مربع كاي لـ McNear.

تؤدي إضافة BSA إلى خلائط التفاعل إلى زيادة عامة في نتائج PCR الإيجابية بسبب إزالة مثبطات PCR في كل من بروتوكول kelex المبسط وبروتوكول التمليح (salting out) العادي. ومع ذلك، لم تكن هذه الزيادة ذات دلالة إحصائية باستثناء جودة DNA في مستخلصات kelex. يتيح الهضم الإنزيمي المقيد النوعي للأليلات لقطعة p falciparum المضخمة تحديد الأنماط الجينية لإصابات الملاريا في المعي المتوسط والغدد اللعابية بحثاً عن أليلات مقاومة للأدوية بمجرد إتقان هذه التقنية.

يجب أن يكون من الممكن تنفيذ هذه التقنية في غضون 37 دقيقة تقريبًا إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.