خلق عابر المسامات غشاء الخلية باستخدام طابعة نافثة للحبر القياسية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء مسام مؤقتة في أغشية الخلايا باستخدام الطباعة بنفث الحبر. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تعديل طابعة نفث حبر قياسية، ثم تتمثل الخطوة الثانية في تفريغ وتنظيف خرطوشة حبر طابعة مخزنة للسماح بإدخال الحبر الحيوي.

بعد ذلك، يتم تعليق الخلايا المستهدفة في محلول من مونومرات الأكتين الموُسمة بفلوروفور ومحلول PBS لتحضير محلول الحبر الحيوي. وتتمثل الخطوة النهائية في طباعة الحبر الحيوي على شرائح مجهرية باستخدام الطابعة والخرطوشة المعدلتين. وفي النهاية، يمكن استخدام المجهر الفلوري لإظهار أن مونومرات G actin المقترنة بـ Fluor four قد تم استيعابها داخل الخلايا المطبوعة من خلال مسام غشائية عابرة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بتقنيات عفن الخلايا (transfection) والحقن المجهري للخلايا القياسية في أن تقنية الطباعة هذه سهلة الاستخدام وتؤدي إلى حيوية خلوية عالية. ورغم أن هذه التقنية يمكن أن توفر رؤى في علم الوراثة، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً في مجالات دراسة أخرى مثل الفيزياء الحيوية الخلوية وهندسة الأنسجة في الفيزياء الحيوية الخلوية. كما يمكن استخدام هذه التقنية لمراقبة الهيكل الخلوي للخلية بسهولة أثناء هجرة الخلايا.

لقد خطرت لنا الفكرة الأولى لهذه الطريقة عندما أردنا أن نكون قادرين على تصور التغيرات في ترتيب الهيكل الخلوي الناتجة عن القوى المطبقة على الخلايا. ابدأ بفك المشابك البلاستيكية من القاعدة السفلية للطابعة، ثم ارفع الغطاء البلاستيكي العلوي ببطء. بعد ذلك، افصل لوحة إضاءة شاشة الأزرار من الجزء العلوي للطابعة، مع إبقائها متصلة باللوحة الأم للطابعة.

باستخدام مناديل Kim والإيثانول، قم بتنظيف الجزء الداخلي من الطابعة، وخاصة المناطق التي تستقر فيها خرطوشة الحبر ومناطق الطباعة. بعد ذلك، حدد موقع الكابل الذي يمد آليات تغذية الورق بالطاقة في طابعة HP desk Jet 500.

توجد هذه الأجزاء أسفل درج الورق مباشرةً إلى يسار الواجهة الأمامية، قم بفصل الكابلات من اللوحة الأم. حدد الآن موقع آلية الكشف عن الورق وقم بتثبيت حلقة سلكية في الرافعة البلاستيكية الرمادية الموجودة أعلى وخلف آلية تغذية ورق الطباعة لتكون بمثابة مقبض يدوي، ثم ضع منصة هنا. يُستخدم حامل الشحن الرغوي المخصص لـ 15 أنبوب طرد مركزي مع تثبيت عدة شرائح مجهرية بشريط لاصق في منطقة الطباعة أمام آلية تغذية الورق، وذلك لرفع شرائح الطباعة المطلوبة إلى مستوى يقع أسفل رأس طباعة الخرطوشة مباشرةً.

أخيرًا، للحفاظ على تقنية التعقيم، ضع الطابعة داخل غطاء التدفق الصفائحي. ابدأ بإخراج الخرطوشة من عبوتها، مع ترك الشريط الواقي الذي يغطي نقاط تلامس الطابعة ورأس الطباعة. ثبّت جسم الخرطوشة باستخدام مشبك، مع ترك الجزء العلوي الأخضر خالًٍا من أي عوائق، وذلك باستخدام أداة قطع دوارة محمولة يدويًا.

اقطع الجزء العلوي الأخضر من الخرطوشة، وأفرغ أي حبر متبقٍ في الخزان، ثم قم بإزالة الشريط الواقي البلاستيكي الذي يغطي نقاط تلامس الطابعة ورأس الطباعة. من المرجح أن يتسرب الماء من رأس الطباعة خلال هذه العملية، ولكن ذلك لن يتسبب في أي ضرر للخرطوشة. وعندما يصبح الماء النازل صافياً، اترك الخرطوشة لتجف.

للحفاظ على بيئة طباعة نظيفة، ابدأ بغمر الخرطوشة بالكامل في دورق مملوء بالماء منزوع الأيونات، ثم قم بإجراء المعالجة بالموجات فوق الصوتية (sonication) للخرطوشة لمدة 15 دقيقة. بعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية، أخرج الخرطوشة وقم بهزها للتخلص من الماء الزائد. رش ethanol بتركيز 70% داخل الخرطوشة لتهيئة بيئة أكثر تعقيماً.

بعد حصاد الخلايا المطلوبة، يتم طرد الخلايا مركزياً في خمسة ملليلتر من الوسط الغذائي الجديد في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 ملليلتر لمدة خمس دقائق عند 250 ×g في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، يتم سحب الوسط الغذائي ثم إعادة تعليق الخلايا بتركيز 1 × 10⁵ خلية/ملليلتر في محلول G actin الفلوري المخزون المُعد حديثاً. لإنشاء الحبر الحيوي، يرجى ملاحظة أن 250 µL من الحبر الحيوي تكفي لطباعة ثلاث شرائح غطاء بنمط الخط الموضح هنا. بعد تشغيل الطابعة وتسخينها، ضع سطح الطباعة المطلوب هنا؛ حيث تُستخدم شرائح غطاء بمقاس 22 mm × 22 mm في مركز المنصة التي تم تجميعها مسبقاً.

بعد ذلك، افتح برنامج رسم واختر النمط المطلوب. الآن، انقل بالماصة ما يقرب من 100 إلى 120 µL من معلق الخلايا إلى البئر الدائري الصغير الموجود في أسفل مقصورة الخرطوشة. اطبع الملف، وبينما تسخن الطابعة مرة أخرى، ستنتقل الخرطوشة إلى وضع الاستعداد.

عندما تتحرك الخرطوشة قليلاً إلى يسار بئر تقطير الحبر وتستقر هناك، اسحب آلية تغذية الورق والسلك، وستبدأ عملية الطباعة. ستقوم الطابعة بالطباعة على غطاء الشريحة الموضوع في مركز منصة الطباعة باستخدام طابعة HP desk jet 500 مع حبر حيوي يتكون من معلق خلايا أرومة ليفية في محلول مونومر G actin.

داخل سلسلة HP 26، تم طباعة خلايا من خراطيش الحبر على شرائح غطاء المجهر الزجاجية. يوضح هذا الشكل نتيجة تمثيلية لخلايا أرومة ليفية مطبوعة تظهر دمج مونومرات الأكتين الفلورية. تم استخدام هذا النمط في الشكل السابق لإنشاء خط مستمر من محلول الطباعة عبر معظم شريحة المجهر.

يوضح هذا الشكل الخط المستقيم الذي تم فيه ترسيب الحبر الحيوي والخلايا بشكل متبادل. لاحظ أنه فور انتهاء عملية الطباعة، تحدث زيادة في تألق الخلفية لأن محلول الحبر الحيوي الذي عُلقت فيه الخلايا يحتوي على فائض حر من مونومرات الأكتين الفلورية؛ إن تحضين الخلايا لمدة 10 دقائق تقريباً بعد الطباعة يسهل التصاقها بالشريحة، مما يسمح بغسل محلول المونومر الزائد من الركيزة باستخدام وسط نمو جديد، وهو ما يقلل بشكل كبير من تألق الخلفية. تظهر هنا صورة تمثيلية لثلاث خلايا ليفية من نوع T3 تم طباعتها في منطقة طباعة محددة، كما يظهر في هذه الصورة المجهرية الفلورية لخلية تم التقاطها بعد 15 دقيقة من الطباعة، حيث تظهر G-actin باللون الأخضر، والنواة باللون الأزرق، وصورة مدمجة لكل من GI actin وصبغة النواة.

تظهر الصورتان التاليتان مجهراً فلورياً لخليتين ليفيتين في نمط خطي بعد ثلاث ساعات من الطباعة. وتوضح الصورة الأولى مونومرات الأكتين المميّزة فلورياً داخل الخلايا. أما الصورة الثانية فهي تراكب للقناة الفلورية مع صورة الخلفية لإظهار أنه على الرغم من احتمال وجود بعض الشوائب على الشريحة في الزاوية السفلية اليسرى، إلا أنها لا تظهر فلورية.

أخيراً، يتم تقديم مجموعة ضابطة من الخلايا غير المطبوعة التي تم تحضينها لمدة ثلاث ساعات مع مونومرات موسومة فلوريسنتياً لإثبات أن المونومرات لا يمكنها اختراق غشاء الخلية دون نفاذية الغشاء الناتجة عن طباعة الخلايا. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم توفير عدة خراطيش نظيفة وجاهزة للاستخدام، حيث يعد انسداد الطابعة أحد المشكلات التي تؤدي إلى إبطاء هذه التقنية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تحويل طابعة مكتبية قياسية لطباعة الخلايا الحية، وهو ما يساعد في توليد قوة غشاء عابرة.