توسيع Nanopatterned ركائز باستخدام تقنية غرزة لNanotopographical التحوير سلوك الخلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج مساحة كبيرة من الركيزة النانوية من قوالب صغيرة ذات منقوشة نانوية باستخدام تقنية غرزة بسيطة وبأسعار معقولة ولكنها متعددة الاستخدامات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في دراسة تعديل الطبوغرافيا النانوية للركيزة للنمط الظاهري للخلية ووظيفتها على المستويات الخلوية والجزيئية ، مثل التعبير عن بروتينات الالتصاق البؤرية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة وفعالة من حيث التكلفة.

للبدء ، قم بإعداد قالب السيليكون السيلاني في البوليمر المسبق PDMS ، كما هو موضح في بروتوكول النص. ضع قالب السيليكون السيلاني في طبق بتري 60 ملم. صب بوليمر PDMS على قالب السيليكون في طبق بتري.

ضع طبق بتري في مجفف بلاستيكي وقم بإزالة الديغا لمدة 10 دقائق تقريبا ، حتى تختفي جميع الفقاعات. انقل طبق بتري إلى طبق ساخن وقم بمعالجة البوليمر المسبق PDMS عند 70 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. انزع قالب PDMS بعناية من قالب السيليكون باستخدام الملقط.

حدد اتجاه الأنماط النانوية PDMS متباينة الخواص ، مثل حواجز شبكية نانوية ، تحت مجهر ضوئي ، وقم بتمييزها على الجانب الخلفي من قوالب PDMS بقلم علامة. نظف ركيزة السيليكون بالإيثانول في غطاء الدخان ، ثم جففها بالهواء المضغوط. قم بقص المناطق غير المنقوشة لكل قالب PDMS بشفرة.

يجب محاذاة قوالب PDMS في أقرب وقت ممكن ، ولكن لا تلمس القالب المحيط ، لتقليل المنطقة غير المنقوشة وتجنب لمس تشوه النمط النانوي عند تطبيق قوة الضاغط. ضع قالب PDMS المشذب مع توجيه النمط النانوي لأسفل على جانب المرآة من ركيزة السيليكون ، ثم قم بمحاذاة القوالب الأخرى بالقرب من القوالب المحيطة ولكن لا تلمسها. من الأهمية بمكان محاولة معالجة PDMS في الطبقة القاعدية لأن PDMS غير المعالج قد يتدفق عبر الفجوة بين القوالب المتعددة ويتلف الأنماط النانوية.

ومع ذلك ، لا يمكن ل PDMS المعالجة تماما ربط القوالب المتعددة معا. لتحضير طبقة لاصقة PDMS ، قم بصب جرام واحد من البوليمر المسبق PDMS منزوع الغاز على شريحة زجاجية نظيفة لتشكيل طبقة بسمك 0.5 ملليمتر. تخبز طبقة PDMS على حرارة 100 درجة مئوية على طبق ساخن لمدة ثلاث إلى خمس دقائق.

استخدم إبرة للمس الطبقة وتأكد من أن الطبقة قد تم علاجها جزئيا ولكن لم يتم علاجها بالكامل. ضع طبقة PDMS على الجانب الخلفي من قوالب PDMS المحاذاة ، واقلب هذه المجموعة بسرعة ، وانقلها إلى اللوح الساخن. قم بتطبيق قوة ضغط باستخدام كتلة معدنية أعلى المجموعة لضمان الاتصال الجيد بين الطبقة اللاصقة PDMS والجانب الخلفي من قوالب PDMS.

عالج الطبقة اللاصقة PDMS عند 100 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. قم بإيقاف تشغيل اللوح الساخن ، وإزالة الكتلة المعدنية ، ونزع قالب PDMS أحادي التثبيت من ركيزة السيليكون. لطباعة قالب PDMS المخيط في لوحة PS ، ضع لوحة PS في فاصل من الألومنيوم مثبتة على رقاقة سيليكون بحجم ثلاثة بوصات.

سخني طبق PS على طبق ساخن على حرارة 250 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، ضع قالب PDMS المخيط ، مع أنماط نانوية مقلوبة لأسفل ، على لوحة PS المنصهرة. بعد ذلك ، ضع لوح ألومنيوم على الشريحة الزجاجية لقالب PDMS المخيط.

قم بالضغط الضغط باستخدام كتل معدنية على لوح الألمنيوم ، وانتظر لمدة ثلاث دقائق. ارفع الكتلة المعدنية واستبدلها من صفيحة الألمنيوم ، وقم بزيادة ضغط الضغط إلى 25 كيلو باسكال. ثم كرر هذه الخطوة مع زيادة الضغط إلى 50 كيلو باسكال.

حافظ على درجة حرارة اللوح الساخن بين 240 و 250 درجة مئوية تحت ضغط ثابت يبلغ 50 كيلو باسكال لمدة 15 دقيقة. قم بإيقاف تشغيل اللوحة الساخنة ، وقم بتبريد الإعداد بالكامل. قم بإزالة الكتل المعدنية بعد أن تقل درجة الحرارة عن 50 درجة مئوية ، وانزع قالب PDMS المخيط بعناية من لوحة PS.

لبصمة قالب PDMS على غشاء رقيق PS ، ضع قالب PDMS المخيط مع التضاريس النانوية ووجهها لأسفل على الفيلم الرقيق PS ، والذي يتم وضعه على لوح ساخن. قم بتطبيق ضغط ضغط يبلغ 12 كيلو باسكال على قالب PDMS باستخدام كتل معدنية على الشريحة الزجاجية لقالب PDMS. ارفعي درجة حرارة اللوح الساخن إلى 180 درجة مئوية ، واحتفظي به لمدة 15 دقيقة.

قم بإيقاف تشغيل اللوحة الساخنة ، وقم بتبريد الإعداد بالكامل. قم بإزالة الكتل المعدنية بعد أن تنخفض درجة الحرارة إلى أقل من 50 درجة مئوية ، وقم بإزالة قالب PDMS المخيط بعناية من فيلم PS. باستخدام لكمة قوس فولاذية مجوفة ، قم بقص ركائز PDMS ذات النمط النانوي إلى أقراص لتناسب تكوين لوحة محددة متعددة الآبار.

بعد ذلك ، استخدم الملقط لوضع أقراص PDMS في آبار الصفيحة متعددة الآبار. تعقيم ركائز PDMS باستخدام 70٪ إيثانول لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، استنشق الإيثانول ، واتبع ذلك بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.

اغسل ركائز PDMS بمحلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات 1X ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم بتغطية ركائز PDMS ببروتين مصفوفة خارج الخلية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اشطف ركائز PDMS ثلاث مرات باستخدام PBS معقم ، كل منها لمدة خمس دقائق.

قم بتعليق خلايا سرطان الرئة البشرية A549 في وسط النسر المعدل من Dulbecco باستخدام مصل بقري جنيني بنسبة 10٪ ، وعد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. قم بلوحة الخلايا بكثافة بذر تبلغ 2 ، 000 خلية لكل سنتيمتر مربع على ركائز PDMS. استزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يوم واحد ، ومراقبتها بعد ذلك.

عرض النمط النانوي المتولد على لوحة PS والفيلم الرقيق هنا. تشير الأسهم إلى ارتفاع البوليمر في فجوات قوالب PDMS المخيطة. توضح صور SEM هذه أن الركائز التي تعمل على PDMS يتم نقلها بأمانة من النمط النانوي المكتوب بالطباعة الحجرية لشعاع الإلكترون من خلال تطبيق تقنية الغرز.

يتم عرض صور SEM التمثيلية لخلايا A549 المزروعة على حواجز شبكية نانوية وأعمدة نانوية هنا. تظهر الخلايا مورفولوجيا الخلية المحاذاة على الحواجز الشبكية النانوية ، بينما تنتشر الخلايا بشكل عشوائي على الأعمدة النانوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء مساحة كبيرة من الركيزة النانوية عن طريق خياطة قوالب متعددة وصغيرة ذات منقوشة نانوية.

لا تنس أن العمل مع التولوين وبارافورمالدهيد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، وارتد دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة أثناء تنفيذ الإجراءات.