نيون الميكروسكوب Lensless على رقاقة

الهدف العام من هذا الإجراء هو استعراض منصة مجهر فلوري على شريحة بدون عدسات لتصوير الأجسام الفلورية عبر مجال رؤية واسع للغاية. ولتحقيق ذلك، يتم وضع مرشح امتصاص رقيق ولوحة وجه للألياف الضوئية برفق فوق مصفوفة مستشعرات كهروضوئية، أو CCDC moss، ثم يتم وضع شريحة مائعية دقيقة فوق لوحة الوجه. بعد ذلك، يتم تجميع منشور مع الشريحة الدقيقة باستخدام زيت مطابقة المعامل.

يتم تحقيق الاستثارة الفلورية من خلال الوجه الجانبي لمنشور معيني الشكل، بينما يتم الإضاءة الهولوغرافية من خلال الوجه العلوي للمنشور نفسه. وفي النهاية، يمكن الحصول على صور مجهرية عالية الدقة من الصور الفلورية المكتسبة عن طريق فك تشفير الصور الخام باستخدام خوارزميات رقمية. وإذا لزم الأمر، يمكن عد الأجسام الفلورية التي تم فك تشفيرها تلقائيًا باستخدام واجهة مطورة خصيصًا.

العدسات على الرقاقة. يهدف التصوير بشكل عام إلى استبدال المجاهر الضوئية الضخمة القائمة على العدسات بتصميمات أبسط وأكثر دمجاً. وتمتلك منصة التكنولوجيا الناشئة هذه القدرة على إلغاء الحاجة إلى المكونات الضخمة وباهظة التكاليف من خلال الاستعانة بنظريات حديثة وخوارزميات إعادة البناء الرقمي.

تتكون قائمة العدسات في منصة التصوير على الرقاقة من عدة مكونات بصرية، بما في ذلك مصفوفة مستشعرات رقمية، ومصدر إضاءة غير متسق، ومنشور، ومرشح امتصاص، ولوحة وجه من الألياف الضوئية، أو مسببر من الألياف الضوئية. وفي هذه المنصة، يمكن استخدام أنواع مختلفة من مصفوفات المستشعرات للكشف عن الإشارة الفلورية من الأجسام الدقيقة المستهدفة. ولأغراض هذا الفيديو، سيتم استخدام جهاز اقتران شحني، ومصدر ضوء غير متسق، مثل صمام ثنائي باعث للضوء بسيط لإثارة الفلورة.

تُستخدم طريقتان مختلفتان لترشيح الاستثارة بالتوازي لإنشاء خلفية المجال المظلم المطلوبة كما هو موضح في هذا المخطط. أولاً، يُستخدم منشور زجاجي أو نصف كرة زجاجية لإحداث انعكاس داخلي كلي (TIR) عند السطح السفلي للشريحة الموائع الدقيقة التي تحتوي على العينات المستهدفة. وبالتوازي مع ذلك، يُستخدم مرشح امتصاص منخفض التكلفة لإزالة أضواء الاستثارة المشتتة ضعيفاً والتي لا تخضع لعملية الـ TIR.

بعد نجاح عملية رفض الإثارة باستخدام هاتين الآليتين، يتم اكتساب الانبعاث الفلوري للعينات فقط عند مستوى الكاشف. وعلى الرغم من الفتحة العددية الكبيرة للكشف، تصبح البقع الفلورية الخام عند مصفوفة المستشعر واسعة إلى حد ما لهندسة وتطوير التحكم في الانتشار المكاني لهذه الإشارة الفلورية بشكل أفضل. سيتم وضع لوحة وجه من الألياف الضوئية بين مستويي الجسم والمستشعر كبديل للوحة الوجه العادية.

يمكن استخدام صفيحة وجه من الألياف الضوئية مستدقة الشكل، والتي تتميز بكثافة أكبر بكثير من كابلات الألياف الضوئية على وجهها العلوي مقارنة بالوجه السفلي، لتحقيق تصوير بدقة أعلى من خلال التكبير. يتم تصنيع الرقائق الموائع الدقيقة المستخدمة في هذه المنصة باستخدام poly dimethyl Sloane walls موضوعة على شرائح زجاجية لإنشاء القنوات الدقيقة اللازمة لبدء تجميع منصة التصوير على الرقاقة عديمة العدسات. أولاً، قم بإزالة الزجاج الغطائي لمصفوفة المستشعرات الكهروضوئية باستخدام قلم تفريغ، ثم ضع مرشح امتصاص رقيقاً برفق فوق المنطقة النشطة للكاشف.

ضع لوحة وجه الألياف الضوئية فوق مرشح الامتصاص هذا. ثم ضع الشريحة الموائع الدقيقة المصنعة مباشرة فوق مصفوفة الألياف الضوئية. بعد ذلك، يتم تجميع منشور زجاجي فوق شريحة الموائع الدقيقة باستخدام زيت مطابقة المعامل بحيث يتطابق معامل انكسار الواجهة مع معامل انكسار الزجاج.

قم بتوصيل مصادر الضوء بالكابلات الليفية الضوئية باستخدام موصلات FC. ويعد محاذاة المكونات أحد أصعب الجوانب في هذا الإجراء؛ لذا يجب محاذاة المسافات بين المكونات، وموضع وزاوية الإضاءة بعناية.

أخيراً، حرك ليف الإضاءة الجانبية ليكون أقرب إلى المنشور واضبط زاويته لضمان حدوث الانعكاس الداخلي الكلي عند الواجهة الفاصلة بين الزجاج والهواء المقابلة للشرائح الموائع دقيقة. يمكن تصوير الركيزة السفلية، أو خلايا متنوعة أو نماذج حيوانية صغيرة باستخدام هذه المنصة المدمجة على الشريحة، ولكن سيتم تصوير خلايا الدم البيضاء لأغراض هذا العرض التوضيحي. لوسم خلايا الدم البيضاء بصبغة فلورية، اخلط أولاً حوالي 100 µL من الدم الكامل مع حوالي 1 mL من محلول منظم لغسل خلايا الدم الحمراء، ثم حضن الخليط لمدة ثلاث دقائق تقريباً في درجة حرارة الغرفة، وبعد ذلك قم بطرد محلول الدم المُحلل مركزياً.

بعد إزالة الطبقة العلوية باستخدام ماصة دقيقة، أعد تعليق طبقة الراسب في محلول ملحي منظم بالفوسفات لوسم الحمض النووي للخلايا بصبغة فلورية، ثم أضف SYTO 16 إلى معلق إعادة التعليق وحضّن العينة لمدة 30 دقيقة تقريبًا في الظلام في درجة حرارة الغرفة. بعد مرور 30 دقيقة، قم بطرد العينة الموّسمة مركزياً. أزل الراشح لتقليل ضوضاء الخلفية الناتجة عن الانبعاث الفلوري للصبغات غير المرتبطة.

قامت ريس بإعادة تعليق طبقة راسب خلايا الدم البيضاء في حوالي 5 mL من PBS. العينة الآن جاهزة ليتم تحميلها في شريحة الموائع الدقيقة للتصوير الفلوري على الشريحة بدون عدسات. وقبل تصوير خلايا الدم البيضاء، يجب معايرة منصة التصوير باستخدام حبيبات مجهرية فلورية.

قم بتحضير عينة مخففة من الخرزات الدقيقة (microbeads) باستخدام الماء منزوع الأيونات ومحلول الخرزات الخام. وباستخدام حقنة ذات إبرة حادة، احقن هذه العينة الأولية في الشريحة الموائعية الدقيقة من جانب جدران PDMS.

بعد تجميع المكونات لتحقيق التصوير الفلوري على الشريحة، يتم الحصول على الصور الخام للخرزات الفلورية باستخدام واجهة LabVIEW التي تم تطويرها خصيصاً عبر جهاز كمبيوتر. تأكد من وجود 20 صورة على الأقل لخرزات فلورية معزولة عبر كامل مجال الرؤية. احفظ بيانات المعايرة، والتي ستُستخدم لاحقاً لمعايرة واستخراج دالة انتشار النقطة (point spread function) لمنصة المجهر الفلوري الخالي من العدسات.

قم بإزالة الشريحة الموائعية الدقيقة التي تحتوي على عينة الخرزات الفلورية وفك المنشور عن هذه الشريحة. احقن عينة خلايا الدم البيضاء التي تم تحضيرها مسبقاً في شريحة موائعية دقيقة أخرى غير مستخدمة من جانب جدران PDMS. قم بتجميع المكونات مرة أخرى وفقاً لنفس الظروف التجريبية، خاصة فيما يتعلق بالمسافات وقدرة الاستثارة.

قم بالتقاط الصور الخام لخلايا الدم البيضاء باستخدام برنامج LabVIEW المخصص مع استخدام نفس معاملات البرنامج المستخدمة مع الخرزات الميكروبية الفلورية. بعد ذلك، تُستخدم بيانات المعايرة وصور خلايا الدم البيضاء الخام لإنشاء صور ذات دقة أعلى في برنامج MATLAB من خلال المعالجة الرقمية. تظهر هنا نتائج ممثلة للتصوير الفلوري على الشريحة باستخدام عدسة واسعة المجال لخليط يحتوي على جسيمات فلورية خضراء بحجم 4 micron و10 micron لأغراض المقارنة، باستخدام مجهر بقوة تكبير 10x.

تم توفير صور مأخوذة بعدسة شيئية أيضًا، وهي تتوافق بشكل جيد مع الصور الفلورية التي تم التقاطها بدون عدسة. بعد ذلك، تظهر نتائج التصوير الفلوري واسع المجال بدون عدسة لخليط يحتوي على جسيمات فلورية خضراء بحجم 10 micron وجسيمات فلورية حمراء بحجم 10 micron. توفر الصور الفلورية التي تم التقاطها بدون عدسة تطابقًا جيدًا مع صور العدسة الشيئية للمجهر بقوة 10x لنفس العينات.

يوفر هذا الشكل مقارنة للأداء بين عملية عكس الالتفاف بطريقة لوسي ريتشاردسون (Lucy Richardson Deconvolution) وأخذ العينات الضغطية بناءً على خوارزميات فك التشفير لتصوير أزواج مختلفة من الخرزات بحجم 10 ميكرون. يوضح الصف العلوي الصور الفلورية الخام بدون عدسات، حيث تظهر الصور المدرجة مقارنات مجهرية لنفس الجسيمات التي تتطلب استخدام عدسة شيئية بقوة 10x. ويوضح الصف الأوسط نتائج فك التشفير الضغطي، بينما يوضح الصف السفلي نتائج عكس الالتفاف بطريقة لوسي ريتشاردسون. تشير DDCS وDLR على التوالي إلى المسافات من المركز إلى المركز والصور المجهرية، وصور العدسات التي تم فك تشفيرها بواسطة CS، وصور بدون عدسات خضعت لعكس الالتفاف بطريقة LR.

بعد ذلك، يتم توضيح المعالجة الرقمية للصور الخام ذات الفلورية المنخفضة والملتقطة عبر العدسة. حيث تُستخدم خوارزمية تعتمد على أخذ العينات الضاغطة لتحقيق دقة مكانية تقل عن 4 µm من خلال تحليل أزواج من حبيبات بقطر 2 µm متراصة بشكل وثيق. وتُظهر الصور المدرجة مقارنات باستخدام عدسة مجهرية بقوة 40x، والتي تتطابق بشكل جيد جداً مع الصور الفلورية التي تم فك تشفيرها.

تشير D هنا إلى المسافات من المركز إلى المركز في صور المجهر. بينما تشير DCS إلى المسافات من المركز إلى المركز في الصور الأقل فلورة الناتجة عن عدسة مفككة باستخدام CS. يوضح هذا الشكل نتائج التصوير بدون عدسات لخلايا الدم البيضاء الموصومة فلورياً.

يتم فك تشفير الصور الخام الخالية من العدسات بسرعة باستخدام مفك تشفير قائم على استشعار المضغوط (CS)، وهو ما يتوافق بشكل جيد جداً مع صورة مجهرية تقليدية لنفس العينة تم الحصول عليها باستخدام عدسة شيئية بقوة 10x. وبالإضافة إلى التصوير عند الحاجة، يمكن أيضاً عدّ الأجسام الفلورية التي تم فك تشفيرها تلقائياً باستخدام واجهة مطورة خصيصاً لتطبيقات قياس التدفق الخلوي على الشريحة. يوضح الشكل هنا واجهة مخصصة ومؤتمنة لعدّ الأجسام الفلورية باستخدام برنامج matlab. لقد استعرضنا للتو إجراء المجهر الفلوري الخالي من العدسات للخلايا المصبوغة والخرز الدقيق عبر مجال رؤية يبلغ ثمانية سنتيمتر مربع.

تعد منصة تصوير الرقاقات هذه، المدعومة بفك تشفير ضاغط سريع، منصة مقارنة؛ حيث ستكون متعددة الاستخدامات في تطبيقات قياس التدفق الخلوي عالية الإنتاجية، والتحليل الدقيق للنادر، وتطبيقات أبحاث الخلايا الحقيقية.