تصور البروتينات والمجمعات ضخم الجزيئات التي كتبها EM اللطخة السلبية : من إعداد الشبكة إلى الحصول على الصور

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور عينات البروتين المنقاة باستخدام المجهر الإلكتروني بصبغة سلبية. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحضير شبكات المجهر الإلكتروني التي ستدعم العينة أولاً، ثم تليها الخطوة الثانية من الإجراء وهي تحضير محلول الصبغة السلبية.

بعد ذلك، تُوضع العينة على شبكة المجهر الإلكتروني وتُصبغ بالصبغة السالبة. وأخيرًا، تُحمَّل شبكة المجهر الإلكتروني في المجهر الإلكتروني، ويتم تسجيل الصور تحت ظروف بصرية مناسبة. وتتميز صور DEM التقليدية ذات المجال المضيء بتباين عالٍ وتفاصيل دقيقة، حيث تُظهر جزيئات كبيرة مفردة مبعثرة فوق خلفية خالية من المعالم.

يعد المجهر الإلكتروني بالصبغة السالبة طريقة بسيطة لتصور البروتين المفضل لديك. ويمكن استخدامه كمقايسة روتينية لفحص البروتين المنقى، سواء للتحليل الهيكلي أو للمقايسات الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية الأخرى. نوضح هنا كيفية تحضير عينة مصبوغة سلبياً للمجهر الإلكتروني.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة مفيداً لأن بعض الخطوات يصعب تعلمها من الأوصاف النصية والأشكال التوضيحية. ابدأ باستخدام ماصة زجاجية لوضع قطرة واحدة من الكولوديون على سطح وعاء كبير من الماء. وبينما ينتشر الكولوديون، فقد يلتقط الغبار الموجود على سطح الماء.

قم بإزالة غشاء بلاستيكي من الكولوديون تجمعت عليه الأتربة واستبدله بقطرة أخرى. بعد ذلك، ضع ما بين 50 و 100 من شبكات EM واحدة تلو الأخرى فوق الغشاء البلاستيكي الطافي بحيث يكون الجانب اللامع متجهاً للأسفل. اختر شبكات ذات مسام 400 mesh لعمليات الصبغ السلبي الروتينية، واختر شبكات ذات مسام 200 mesh.

لجمع صور أزواج الإمالة. اختر قطعة من الورق غير المجعد بطيء الامتصاص تكون أكبر قليلاً من مساحة الشبكات. ضع الورق فوق الشبكات وانتظر حتى يبتل الورق تماماً.

يجب ألا تمتص الورقة الماء بسرعة كبيرة. نستخدم ورقة من دفتر ملاحظات رخيص الثمن. الآن أصبحت الشبكات محصورة بين الغشاء البلاستيكي والورقة.

استخدم ملقطاً لوضع الورقة في طبق بتري لتجف ببطء في الهواء. تجنب طرق التجفيف السريعة لأنها قد تؤدي إلى ظهور تجاعيد. جهاز طلاء الكربون المستخدم في مختبرنا هو Creston 2 0 8 C high vacuum turbo carbon coer.

مجهز بجهاز Creston لمراقبة سمك الغشاء. يستخدم جهاز المراقبة ميزان كوارتز حساساً لترسبات الكربون. ومع ذلك، فإن البروتوكول الموصوف هنا لا يتطلب استخدام هذا الجهاز. ابدأ بشحذ وتحميل قضبان الكربون في آلة طلاء الكربون.

قم بتغطية شريحة زجاجية بشحم الفراغ مع ترك نصف المنطقة المضببة بدون تغطية. بعد عملية التغطية بالكربون، تُستخدم المناطق المدهونة بالشحم على الشريحة لتقدير سمك طبقة الكربون. ضع الورقة التي تحتوي على الشبكات على المنصة تحت الجرس الزجاجي لجهاز التغطية بالكربون. قم بتثبيت الزجاج المدهون بالشحم في موضعه.

قم بإزاحة الشريحة لتصبح بجانب الشبكات. قم بتفريغ غرفة التفريغ حتى تصل إلى 10 micro tours على الأقل، وإلا فإن حدوث الشرارات سيؤدي إلى توليد العديد من الجزيئات الكبيرة في الشبكة. الآن، قم بزيادة التيار ببطء شديد.

سيصبح الطرف المدبب لقضيب الكربون ساطعاً للغاية. لا تراقبه بالعين المجردة عند بدء عملية الطلاء، وستتغير لون الشريحة الزجاجية إلى الرمادي الداكن مع تراكم طبقة الكربون؛ قم بقطع التيار عند الوصول إلى سمك الكربون المطلوب مع مراعاة شفافية الوعاء الزجاجي (bell jar). عند اتخاذ هذا القرار، وبمجرد معايرة درجة قتامة الشريحة وفقاً لسمك الكربون، تصبح هذه الطريقة دقيقة تماماً مثل جهاز مراقبة سمك الغشاء الأكثر تكلفة.

عند انتهاء العملية، قم بتنفيس غرفة التفريغ وإخراج الشبكات المطلية لاستخدامها لاحقاً. لن تؤثر الطبقة البلاستيكية الرقيقة على جودة الصورة المصبوغة سلبياً، ولكن يمكن إزالتها عن طريق نقع الشبكات في الكلوروفورم لعدة ساعات قبل المتابعة. قم بتحضير محلول فورمات اليورانيل طازجاً أو استخدم محلولاً تم تخزينه في الظلام لمدة تقل عن أسبوعين.

يتميز المحلول الطازج الجيد بلون أصفر، ودرجة pH تبلغ حوالي 4، ويكون نقيًا جدًا وخاليًا من أي رواسب. ابدأ باستخدام نظام متاح تجاريًا للتوهج. قم بتفريغ الشحنات من الشبكات المطلية بالكربون.

بعد ذلك، ضع قطرتين من الماء المقطر بحجم 20 µL وقطرتين من محلول فورمات البول الطازج بحجم 25 µL على قطعة من ورق البارفيل. وباستخدام ملاقط مضادة للشعيرات الدموية ذات قوة عكسية، أمسك بشبكة مفرغة من الشحنات المتوهجة، بحيث يكون الجانب المطلي بالكربون متجهاً للأعلى. ومن الضروري ملاحظة أن هذه الملاقط لا تسحب السوائل من الشبكات.

قم الآن بوضع 2 µL من عينة البروتين على الشبكة وانتظر حتى يتم امتصاص البروتينات داخلها. تستغرق هذه العملية عادةً 30 ثانية، ولكن العينات المخففة للغاية ستتطلب وقتاً أطول، مما قد يؤثر على تركيزات المنظم. عند الانتهاء، قم بتجفيف عينة البروتين باستخدام ورق ترشيح.

بعد ذلك، اغسل الشبكة مرتين عن طريق ملامسة سطحها لفترة وجيزة بقطرة من الماء وتجفيفها بالتربيت في غضون ثوانٍ قليلة. وبعد ملامسة الماء للشبكة لفترة وجيزة، المس بقطرة من الصبغة ثم جففها سريعاً بالتربيت. وباستخدام التقنية نفسها، اترك الشبكة في حالة تلامس مع قطرة ثانية من الصبغة لمدة 20 ثانية.

أخيراً، جفف الشبكة بالهواء في غطاء سحب الأدخنة، أو يفضل في جهاز تفريغ قبل جلسة المجهر الإلكتروني (EM)، وتحقق من محاذاة المجهر الإلكتروني عبر تحميل ملف محاذاة مُحسّن إذا كان متاحاً، وهو ما ينبغي أن يعيد الجهاز إلى حالة تقارب المثالية. والآن، قم بتحميل شبكة المجهر الإلكتروني في حامل عينات قياسي أحادي الإمالة. بعد ذلك، أدخل الحامل في المنصة.

بعد ذلك، انتظر حتى تكتمل دورة الضخ ثم أدخل الحامل في العمود. ابدأ الآن بالبحث عن منطقة عينة ذات صبغ جيد. قم بالتركيز يدويًا باستخدام طريقة الحد الأدنى من التباين أو باستخدام كاميرا CC، D وحساب البؤرة المباشرة.

طيف القدرة الخاص بك. ثم قم بضبط التركيز العميق حسب الحاجة، وعادة ما يكون على -1.5 microns. قد يختلف تركيز الصبغة عبر الشبكة، لذا ابحث عن البروتينات ذات التباين الأبيض.

تجنب المناطق التي تعاني من تلون غير متساوٍ أو تلون إيجابي حيث يصبح تباين البروتين أسود. باستخدام النهج الموضح لإعداد الشبكات وتصوير العينات المصبوغة سلبيًا. تم تصوير العديد من البروتينات المألوفة لأغراض التوضيح.

لاحظ دقة تفاصيلها وتباينها الحاد. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تحضير عينات من الجزيئات الكبيرة المصبوغة سلبياً لفحصها باستخدام المجهر الإلكتروني. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون أربع ساعات تقريباً.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل إعادة البناء ثلاثية الأبعاد (3D reconstruction) من أجل فهم البنى الجزيئية بشكل أفضل.