تجارب أداء مخصص ميكروأري MicroRNA

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء تجربة مصفوفة ميكرو آر إن إيه (micro RNA microarray). يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال الحصول على شرائح مصفوفات مطبوعة تحتوي على مكتبة من مجسات micro RNA، وتجهيز عينات RNA ذات جودة وكمية مناسبتين. بعد ذلك، يتم وسم عينات RNA وعينة DNA ضابطة باستخدام صبغات فلورية.

بعد ذلك، تُضاف الأحماض النووية المُعلمة إلى شريحة المصفوفة الدقيقة (microarray) لإجراء عملية التهجين. وأخيرًا، تُغسل شريحة المصفوفة الدقيقة وتُمسح ضوئيًا ثم يتم تجديد الشريحة. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تُظهر التعبير الجيني لـ microRNAs على نطاق الجينوم كاملاً من خلال تحليل الشريحة لتحديد شدة التهجين لسابرات micro RNA الفردية.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال التعبير الجيني، مثل كيفية تأثير الظروف الفسيولوجية الطبيعية أو الحالات المرضية بشكل تفاضلي على احتياجات التعبير عن المصفوفات الدقيقة على نطاق عالمي. وتعد جودة تصنيع المصفوفة الدقيقة أحد أكثر العوامل حسمًا لنجاح تجربة المصفوفة الدقيقة. بعد عزل RNA باستخدام طريقة تحافظ على جزيئات RNA الصغيرة وإعادة تعليقه بتركيز يساوي أو يزيد عن 2 mg/mL، يتم وسم RNA في حجم تفاعل قدره 20 µL عن طريق خلط حوالي 25 µg من RNA الكلي مع 0.5 µg من 5' P-C-U-D-Y 5 4 7 3' في buffer HEPs بتركيز 1X مدعم بـ T4 RNA Ligase 1D TT وATP. وفي حال توفر كمية أقل من RNA، يتم تقليل كمية RNA وحجم التفاعل تناسبيًا.

إذا كان الحمض النووي الريبوزي (RNA) مخففاً جداً، أضف مادة حاملة مثل tRNA من الخميرة للمساعدة في الترسيب، ثم قم بتحضين التفاعل على الثلج داخل الثلاجة لمدة تتراوح من ساعتين إلى 24 ساعة. بعد ذلك، أضف خلات الصوديوم لتصل إلى تركيز 0.3 molar، ثم أضف ثلاثة أحجام من ethanol وقم بترسيب RNA طوال الليل عند درجة حرارة 20- درجة مئوية. لاستخدام الشرائح للمرة الأولى، قم بإجراء تهجين مسبق لها في محلول مرشح مكون من 3 XSSC و 0.1% SDS و 0.2% BSA لمدة تتراوح من 30 إلى 60 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.

بعد ذلك، اغمر الشرائح في الماء عدة مرات. ثم في الإيزوبروبانول، جفف الشرائح باستخدام جهاز طرد مركزي مزود بمحول شرائح عند 100 ×g لمدة خمس دقائق عند 22 °C. اشطف شرائط الرفع في الماء.

بعد ذلك، وفي الإيثانول وقبل التجفيف في الهواء، ضع شريحة داخل قاعدة غرفة تهجين المصفوفات الدقيقة، ثم ضع شريحة رافعة فوق الشريحة بحيث تغطي الشريحة الرافعة منطقة المسبار وشرائطه البيضاء. قم بمعالجة الشريحة في الظلام، ثم قم بطرد مركزي لترسيب الـ RNA المسمى، واغسله مرة واحدة بـ 70%ethanol وجفف الراسب في الهواء. يجب أن يكون لون الراسب مائلاً إلى الحمرة.

قم بتحضير محلول التهجين باستخدام حجم يتراوح بين 1/15 إلى 1/100 من الحمض النووي المرجعي المسمى والمنقى لكل عينة RNA. قم بإذابة كتلة RNA تماماً باستخدام حوالي 60 µL من محلول التهجين لضمان عدم جفاف محلول التهجين. وأثناء الحضن، أضف 20 µL من الماء إلى كل بئر من آبار الترطيب في قاعدة غرفة تهجين المصفوفة الدقيقة.

أضف خليط الـ RNA المسمى والـ DNA المرجعي إلى الشريحة. وباستخدام طرف ماصة رفيع، المس طرف شريحة الرفع برفق وعن طريق الشفط، اسمح للمحلول بالدخول في المساحة الموجودة بين شريحة الرفع والشريحة.

ضع غطاء غرفة التهجين فوق القاعدة. ثم أحكم إغلاق الغرفة باستخدام المشابك المعدنية. ضع الغرفة بأكملها داخل الكيس البلاستيكي المرفق مع كاسيت الغرفة.

أخيرًا، ضع كاسيت الغرفة داخل حاوية تحتوي على منشفة ورقية مبللة. ثم غطِّ الحاوية بغلاف بلاستيكي وضعها داخل حاضنة زراعة خلايا رطبة عند درجة حرارة 37 degree Celsius لمدة 24 ساعة تقريبًا. ولمعالجة الشرائح بعد التهجين، قم بتفكيك كاسيتات الغرف واحدة تلو الأخرى واغمر الشريحة ورافعة الشريحة المرافقة لها في 2XSSC عند درجة حرارة 22 degrees Celsius.

سيسقط شريط الرفع طبيعياً عن الشريحة، اغسل الشرائح في محلول 0.8 XSSC مرتين، ثم ثلاث مرات في محلول 0.4 XSSC لمدة إجمالية تتراوح من دقيقة إلى دقيقتين. جفف الشرائح باستخدام جهاز طرد مركزي مزود بمهايئ للشرائح. بعد ذلك، قم بمسح الشرائح ضوئياً باستخدام ماسح للمصفوفات الدقيقة، واستخدم برنامجاً مثل blue fuse لتقدير شدة الإشارات في ملفات الصور.

افحص البقع الفردية لاستبعاد البقع غير الطبيعية التي تنتج عادةً عن طباعة شريحة المسام أو التعامل مع الشريحة بعد التهجين. ولتحليل البيانات وعرضها، استخدم برامج مثل gene springing وexcel لإعادة استخدام المصفوفة الدقيقة. قم بإزالة المحتوى من الشريحة عن طريق شطفها بالماء، ثم غمرها في وعاء تلوين يحتوي على 1 millimolar NAOH و0.1 XSSC مسخن مسبقًا عند 62 °C لمدة تتراوح من 10 إلى 20 دقيقة.

كرر عملية التحضين مرة ثانية. اغسل الشرائح عدة مرات بالماء لمدة تصل إلى 60 دقيقة مع الرج اللطيف عند 22 degrees Celsius. جفف الشرائح باستخدام جهاز طرد مركزي واحفظها عند 22 degrees Celsius.

يمكن استخدام الشرائح دون إجراء تهجين مسبق. يوضح هذا الشكل صورة ممسوحة ضوئياً لمصفوفة مجهرية تظهر إشارات تهجين دقيقة وقوية للغاية. نتجت البقع الحمراء من تهجين DNA المرجعي، والبقع الخضراء من عينة RNA الموزونة بـ DY 5 47، بينما نتجت البقع الصفراء عن تهجين كل من DNA وRNA مع ذات المجسات.

تبلغ معاملات ارتباط بيرسون بين المكررات التقنية لتهجين المصفوفات الدقيقة حوالي 0.99، مما يشير إلى إمكانية تكرار ممتازة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تجربة مصفوفة دقيقة مخصصة، ليس فقط لتقدير كمية micronase، بل وأيضاً لتقدير كمية أنواع أخرى من الأحماض النووية مثل mRNAs.