الفحص البروتين تراكب الأغشية : بروتوكول لاختبار التفاعل بين البروتينات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان في المختبر

اختبار البروتين. يُعد التفاعل البروتيني أمراً لا غنى عنه لتحليل الوظائف البروتينية. يقدم هذا الفيديو مقايسة ربط بروتيني-بروتيني في المختبر لاختبار التفاعل بين بروتين غشائي مثبت وبروتين ذائب.

أولاً، يتم استنساخ البروتينات الاندماجية والتعبير عنها واستخلاصها. ثم يتم تثبيت البروتين غير الذائب الموسوم على غشاء النيتروسليلوز ومعالجته لإعادة طيه إلى شكله الأصلي. بعد ذلك، يتم فحص الغشاء باستخدام بروتينات ذائبة موسومة، ويُجرى التلطيخ المناعي للكشف عن البروتينات.

إذا تفاعلت البروتينات الموُسمة، فسيتم التقاطها بواسطة البروتين المثبت على الغشاء، وسوف تُلاحظ الإشارة الناتجة عن اللطخة المناعية. وبالتالي، يوفر هذا المقايسة طريقة موثوقة لاختبار التفاعل بين بروتين غير ذواب وبروتين في محلول. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنةً بالوسائل الحالية مثل سحب GST، في إمكانية تقييم الارتباط بين البروتين غير الذواب والبروتين الذواب موثوقيةً في المختبر (in vitro).

تتمثل الخطوة الأولى من هذا الإجراء في توليد بروتينات موسومة جينياً لغرض الكشف. ابدأ باستنساخ البروتين الذي سيتم تثبيته على الغشاء؛ ويُشار إليه هنا باسم pro Im للبروتين المثبت في ناقل تعبير، مع ترميز وسم كبير مثل GST. أما ناقل التعبير الفارغ، الذي يرمز للوسم فقط، فسيُستخدم كعنصر تحكم سلبي للبروتين المثبت، ويُشار إليه باسم pro IM nc.

بعد ذلك، قم باستنساخ البروتين الذي سيُستخدم كمسبار ذائب في ناقل تعبير، بحيث يتم تشفير وسم مختلف مثل strep two. سيُشار إلى هذا البروتين باسم prosol (البروتين الذائب). وكعنصر تحكم سلبي، قم باستنساخ بروتين ذائب للتحكم السلبي في ناقل التعبير نفسه، وسُيشار إليه باسم Prosol NC (البروتين الذائب للتحكم السلبي).

بعد ذلك، استخدم نظام تعبير بروتيني مثل *E. coli* أو فيروس balo للتعبير عن البروتينات الملحقة بعلامة؛ ويجب اختيار نظام التعبير بعناية بناءً على المتطلبات الخاصة بتعديلات ما بعد الترجمة. استخلص البروتينات المُعبَّرة من الكائن الحي المختار. بالنسبة لـ pro IM و pro I mnc Resus.

قم بتعليق الخلايا في محلول تحميل SDS page الذي يحتوي على خليط مثبط البروتياز. بعد ذلك، اغْلِ الخلايا لمدة خمس دقائق، ثم قم بطردها مركزياً لإزالة الراسب لاستخلاص Prosol و prosol NC. استخدم الإجراءات القياسية. يمكن استخلاص pro IMS تحت ظروف مسخ البروتين لأن البروتينات ستعيد تشكلها بعد تثبيتها في غشاء النيتروسليلوز.

ومع ذلك، يجب استخلاص prosol لإجراء تأكيد أصلي لأنها ستضاف إلى محلول الربط بمجرد استخلاص البروتينات الملحقة. حدد تركيز البروتينات المؤتلفة باستخدام طريقة قياسية مثل مجموعة فحص بروتين BioRad، في حال استخدام المستخلص الخام بدلاً من البروتين المنقى في الفحص.

قم بتقدير تركيز البروتين المستهدف عن طريق قياس الكثافة الضوئية (scanning densitometry) للنطاق المقابل على هلام SDS poly acrylamide المصبوغ بصبغة kumasi، مع استخدام تركيزات معروفة من BSA كمرجع. ثم ارسم منحنى القياس المعياري بناءً على شدة الإشارات المقاسة بواسطة قياس الكثافة الضوئية لـ BSA، واحسب كمية البروتين الموجودة في المستخلص الخام.

تتمثل الخطوة التالية من الإجراء في تثبيت pro Iam وpro IAM NC على الغشاء. ابدأ بتحميل ميكروغرام واحد من مستخلصات pro Iam وpro IAM NC، في مكررات، على هلام SDS poly acrylamide. بعد عملية الرحلان الكهربائي، قم بإزالة الهلام من الصفائح الزجاجية ووضعه في 100 milliliters من محلول نقل، ثم يتم التحضين مع التقليب اللطيف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد انتهاء فترة الحضن، قم بإجراء تحليل لطخة ويسترن (western blot) لنقل البروتينات إلى غشاء نيتروسليلوز، ثم اترك الغشاء بعد النقل للسماح للبروتينات المرتبطة بالغشاء بإعادة التشكل. ضع الغشاء في 15 milliliters من المنظم A وقم بحضنه مع الرج الخفيف. ولإزالة ما تبقى من SDS، يتم الحضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الرج الخفيف.

بعد انتهاء فترة التحضين، قم بإزالة الغشاء بعناية من المحلول المنظم. ثم ضع الغشاء في 25 milliliters من محلول التمسخ المنظم. يتم التحضين لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع الرج اللطيف.

خلال فترة الحضن، سيصبح غشاء النيتروسليلوز معتمًا. بعد ذلك، وباستخدام الملاقط، انقل الغشاء إلى 25 milliliters من TBS واحضنه مع الرج الخفيف لمدة خمس دقائق. وخلال هذه الخطوة، يعود الغشاء إلى لونه الأبيض الأصلي.

بعد ذلك، انقل الغشاء إلى 25 milliliters من محلول الربط المنظم. يتم التحضين عند درجة حرارة أربع degrees Celsius مع الرج اللطيف طوال الليل. تالياً، سيتم استخدام البروتين الذائب لسبر الغشاء بحثاً عن البروتين المثبت.

أولاً، قم بتحضير محاليل التهجين المنظمة عن طريق تخفيف 1 إلى 10 ميكروجرام من prosol و prosol NC في أنابيب منفصلة تحتوي كل منها على 10 ملليلتر من محلول الربط الطازج. ثم انقل المحلول المنظم إلى كيس التهجين. بعد ذلك، قم بقص الغشاء إلى شريطين، بحيث يحتوي كل منهما على pro IM و pro IAM nc.

سيتم وضع هذه الأغشية في محلول التهجين. انقلي كل غشاء إلى محلول تهجين prosol أو prosol NC واحضنيه لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع التقليب اللطيف. أزيلي الأغشية من محاليل التهجين واغسليها ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة في محلول TBS.

لتصوير التفاعلات بين البروتينات، قم بحجب الغشاء باستخدام 2.5%skim milk في TBST لمدة ساعة واحدة. بعد فترة الحضن، ضع الأغشية المحجوبة في محلول الجسم المضاد الأولي. يُستخدم هنا antis strep two polyclonal rabbit antibody.

يُحضن الخليط لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع التقليب اللطيف بعد عملية التحضين. تُشطف الأغشية في 20 milliliters من TBST لمدة 15 دقيقة، ثم تُشطف مرتين لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التقليب اللطيف. بعد ذلك، توضع الأغشية في محلول الجسم المضاد الثانوي المقترن بـ HRP، حيث يُستخدم هنا جسم مضاد لـ rabbit IgG مقترن بـ HRP.

يُحضن المزيج لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الرج اللطيف. تُغسل الأغشية في 20 milliliters من TBST لمدة 15 دقيقة، ومرتين لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الرج اللطيف كما سبق، وبعد الشطف النهائي في TBS، يتم تصوير التفاعل البروتيني-البروتيني باستخدام ركيزة HRP الكيميائية المضيئة من شركة Millipore. Im Molan Western Chemiluminescent.

يُستخدم ركيزة HRP بعد عملية التحليل المناعي (immuno blotting) للبروسول. يتم شطف الغشاء باستخدام TBST لمدة 15 دقيقة، ثم مرتين لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، يتم إعادة فحص الأغشية باستخدام الجسم المضاد الأولي الخاص بالوسم للبروسول.

يتبع ذلك إضافة الجسم المضاد الثانوي المناسب. يتم تصور PRO I و pro Im NNC عن طريق الكشف عن التألق الكيميائي للتحقق من هوية الحزم التي تم الحصول عليها في مقايسة التراكب لغشاء البروتين. كما تم تقييم التفاعل بين البروتينات A و K و YFP و MP CYFP في خلايا بشرة التبغ باستخدام الطريقة الموضحة في هذا الفيديو كما هو مبين هنا.

عندما تم تقييم التكامل الفلوري للجزيئات الحيوية، تمت إعادة بناء إشارة YFP قوية. تجمعت إشارة BFC هذه في Punta عند محيط الخلية، وهو ما يشخص الغشاء البلازمي لأن MP بروتين غير قابل للذوبان للغاية. وعند التعبير عنه في البكتيريا أو النباتات، تم اعتماد مقايسة تراكب غشاء البروتين للتحقق من هذا التفاعل.

تم فصل مستخلصات البروتين في المختبر التي تحتوي على ميكروجرام واحد من GST MP أو GST غير المدمج باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد SDS، متبوعاً بالنقل الكهربائي إلى غشاء نيتروسليلوز. وعند فحص هذه البروتينات باستخدام soluble a nnk strep two، أظهر GST mp ارتباطاً، بينما لم يظهر GST غير المدمج ذلك. علاوة على ذلك، عندما تم فحص المجموعة نفسها من البروتينات باستخدام Arabidopsis Cytoplasmic, NADH kinase tagged strep two، وهو بروتين غير مرتبط، لم يُلاحظ أي ارتباط، مما يؤكد خصوصية تفاعل A NK MP. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إعادة ملء البروتينات المثبتة بشكل صحيح وفقاً للبروتوكول المعروض.