بروتوكول بسيط لتجمع الصفائح الدموية بوساطة

يوفر هذا الإجراء بعض الإرشادات الموحدة لإجراء فحوصات التكتل بوساطة الصفائح الدموية لعزلات plasmodium false parem السريرية أو المختبرية. أولاً، يتم جمع الدم من مريض مصاب وحصد الكريات الحمراء المصابة بالطفيليات عن طريق الطرد المركزي، ثم استزراع وتنقية المراحل الناضجة اللاجنسية. بعد ذلك، يتم جمع الدم من متبرع سليم من أجل تحضير وتوحيد البلازما الغنية بالصفائح الدموية عن طريق الطرد المركزي.

اجمع كلاً من الصفائح الدموية وكريات الدم الحمراء المصابة بالطفيليات من أجل اختبار التكتل. يمكن أن تُظهر نتائج المجهر الفلوري المناعي تكتلات P Fal sperum التي تتوسطها الصفائح الدموية. وقد صُممت هذه التقنية خصيصاً لقياس النمط الظاهري للتكتل الخاص بـ plasmodium sra.

العزلات السريرية في بيئة محدودة الموارد. فقد ورد أن التباينات الطفيفة في الإجراءات تزيد من التأثير على نتيجة اختبار التكتل الحمضي في الميدان. ولذلك، كانت هناك حاجة إلى بروتوكول واضح وسهل الاتباع مكيف مع البيئات محدودة الموارد لتوحيد العمل عبر المواقع الميدانية الموبوءة بالملاريا. في أنبوب سحب دم (vacutainer) يحتوي على سترات الصوديوم، يتم جمع ما يقرب من خمسة مليلتر من الدم الكامل من مضيف غير مصاب بالملاريا، أو 2.5 مليلتر من دم المرضى المصابين بملاريا الدماغ (CM) أو الملاريا الشديدة (SM).

قم بطرد الدم الكامل مركزياً عند 250 Gs لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم انقل السائل الطافي العكر بعناية إلى أنبوب نظيف سعة 15 milliliter. تذكر أن الصفائح الدموية يتم تنشيطها بسهولة بفعل تغيرات درجة الحرارة والصدمات الفيزيائية.

قم بتعداد تعليق PRP باستخدام غرفة عد كرات الدم (hemocytometer)، واضبط التركيز المطلوب باستخدام PBS للحصول على راسب بلازما فقيرة بالصفائح الدموية، وذلك بفصل معظم الصفائح الدموية من جزء من كسر PRP عن طريق الطرد المركزي عند 1500 GS لمدة 10 دقائق. تُحفظ كسور PRP وPPP عند درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى 8 إلى 10 أيام. ويُفضل استخدام صفائح دموية حديثة لإجراء مقايسة التكتل.

اغسل خلايا الدم الحمراء الطرفية المترسبة ثلاث مرات باستخدام 5 إلى 10 مللي لتر من وسط RPMI 1640 في قارورة زراعة. قم بتكملة خلايا الدم الحمراء الطرفية (PRBC) بوسط زراعة الملاريا القياسي وخلايا دم حمراء طازجة غير مصابة لتحقيق نسبة هيماتوكريت 5%. قم بتخلخل قوارير الزراعة بخليط مكون من 92.5% نيتروجين، و2.5% أكسجين، و5% ثاني أكسيد الكربون. ثم أحكم إغلاقها وازرعها للحصول على طفيليات ناضجة من خلايا الدم الطرفية (pbcs) الخاصة بالمريض.

يتم تحضين دورق المزرعة لمدة تتراوح بين 24 إلى 36 ساعة في حضانة عند درجة حرارة 37 degrees Celsius وبنسبة 5% carbon dioxide. ضع ما يقرب من 10 إلى 15 µL من الدم على أحد طرفي شريحة زجاجية ذات وجه مصنفر موضوعة على سطح مستوٍ. المس قطرة الدم بحافة شريحة ثانية حتى ينتشر الدم بالتساوي عبر حافة الشريحة الثانية مع إمساك الشريحة الثانية بزاوية 45 درجة.

بسرعة وبلطف، وبدون الضغط بشدة على الشريحة الأولى، قم بتوزيع الدم بالتساوي على الشريحة الأولى. بعد ذلك، اترك طبقة الدم الرقيقة تجف في الهواء، ثم قم بتجفيف منطقة العينة باستخدام الميثانول لمدة 10 ثوانٍ. ثم اتركها تجف في الهواء مرة أخرى، ثم اغمر العينة في 2%keem.

اترك العينات لمدة 10 دقائق على الأقل. اشطفها جيداً حتى يصبح الماء صافياً، ثم اتركها لتجف في الهواء. افحص العينات باستخدام عدسة انغماس زيتية بقوة تكبير 100x تحت المجهر الضوئي.

بعد ذلك، قم بتنقية ومزامنة خلايا PFS parum الناضجة، PRBC كما هو موضح في البروتوكول النصي. انقل المزرعة بالكامل إلى أنبوب نظيف ومعقم سعة 15 milliliter. قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة عند 370 GS لمدة خمس دقائق.

الآن، قم بسحب السائل الطافي بعناية دون تعكير الراسب. بعد ذلك، أعد تعليق الخلايا بحيث يكون نصف الحجم الإجمالي عبارة عن jello fusing. أما النصف الثاني، فيكون ثلثه وسطاً خالياً من البروتين والثلثان الآخران عبارة عن pbcs.

انقل المعلق إلى أنبوب معقم سعة 15 milliliter واحضه لمدة تتراوح بين 15 و 20 دقيقة في حاضنة بدرجة حرارة 37 degrees Celsius حتى يتشكل حد فاصل واضح بين المستويين العلوي والسفلي. انقل الطبقة العليا بعناية إلى أنبوب معقم جديد سعة 15 milliliter وأضف 10 milliliters من وسط RPMI طازج، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 370 إلى 430 GS لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، تخلص من الراشح بعناية.

الآن، قم بتقييم نسبة الطفيليات والمرحلة التنموية عن طريق لطخة دم رقيقة وفحصها تحت مجهر ضوئي كما تم وصفه سابقاً. قم بتعديل معلق P RBCs الذي تم الحصول عليه بعد تعويم هلام البلازما ليصبح 1 × 10⁸ P RBCs لكل µL في أنبوب جديد سعة 1.5 mL. نقوم بتعليق pbcs عند 5% hematocrit مع إضافة acridine orange أو ethidium bromide بتركيز نهائي 20 µg/mL، وPRP بنسبة 10% من الحجم الإجمالي.

وبالمثل، قم بتحضير الضوابط التالية: كريات دم حمراء غير مصابة، وبلازما غنية بالصفائح الدموية (PRP)، وكريات دم حمراء مركزة (PRBC) مع بلازما فقيرة بالصفائح الدموية (PPP)، وذلك للتأكد من دور الصفائح الدموية في تكتل خلايا الدم الحمراء المصابة (PBC). الآن، انقل المعلق إلى أنبوب ذو غطاء لولبي سعة 2 مل. ضع الأنبوب تحت تقليب لطيف عن طريق الدوران بسرعة 10 إلى 12 RRP في درجة حرارة الغرفة، مع أخذ عينات على فترات زمنية تتراوح بين 15 إلى 20 دقيقة لمدة إجمالية تصل إلى 120 دقيقة لفحص تكوين التكتلات.

قم بنقل 10 µL من العينة باستخدام الماصة إلى شريحة زجاجية وغطّها بغطاء شريحة زجاجي للفحص تحت المجهر الفلوري؛ وتُعتبر الكتلة عبارة عن تجمع لثلاث خلايا دم حمراء مصابة أو أكثر. قامت هذه التجربة بفحص ما يقرب من 70% من المراحل الناضجة لـ p FALs parem بعد الإثراء عن طريق تعويم هلام البلازما، ويمكن رصد الكتل بسهولة تحت المجهر كما هو الحال في الضوء العادي، حيث تظهر كتجمعات خلوية، بينما تظهر تحت الفلورية كنقاط خضراء أو حمراء.

عند الصبغ بصبغات acridine orange أو ethidium bromide على التوالي، يزداد حجم التكتل بشكل ملحوظ ليصل إلى متوسط يزيد عن 15 pbcs لكل تكتل بعد الحضن لمدة 120 دقيقة، مع احتواء بعض التكتلات على أعداد عديدة من pbcs لكل تكتل تعذر عدها بصرياً. ويتم حساب تكرار النمط الظاهري للتكتل كعدد الخلايا المصابة الموجودة في تكتلات لكل 1000 خلية مصابة تم عدها في مقاييس مكررة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك الآن فهم واضح لكيفية إجراء مقايسة التكتل بوساطة الصفائح الدموية لـ plasmodium falciparum. احرص على عدم تنشيط الصفائح الدموية من خلال الحركات المفاجئة أو تغيرات درجة الحرارة. يمكن تطبيق هذه المقايسة أيضاً لقياس مقايسة التكتل بوساطة الصفائح الدموية في حالات الملاريا الشديدة.