تتبع الزحف داخل اللمعة العدلات ، والهجرة والانجذاب الكيميائي Transendothelial في الأنسجة بواسطة الميكروسكوب فيديو Intravital

الهدف العام من هذا البروتوكول هو استخدام التصوير المجهري الحي للفحص بالمجال المضيء (Brightfield) وتصوير الفيديو بنظام الفاصل الزمني لدراسة التفاعلات الديناميكية بين الخلايا المتعادلة والخلايا البطانية أثناء تجنيد الخلايا المتعادلة استجابةً لجذب الخلايا المتعادلة كيميائياً في الجسم الحي. في هذا الفيديو، نوضح إجراءات كيفية استخدام المجهر الحي بالفحص بالمجال المضيء لتصوير وتحديد الزحف داخل اللمعة للخلايا المتعادلة، والهجرة البطانية، والانجذاب الكيميائي في أنسجة العضلات المخططة لدى الفأر. يعد تجنيد الكريات البيضاء السمة المميزة للالتهاب.

تبدأ عملية التجنيد هذه عندما تبدأ الكريات البيضاء في مجرى الدم بالتدحرج على البطانة الغشائية للأوردة ما بعد الشعيرية في موقع الالتهاب. واستجابةً للكيموكينات أو جاذبات كيميائية أخرى على السطح اللمعي، تتوقف هذه الكريات البيضاء المتدحرجة وتلتصق بقوة بالبطانة الغشائية. وبعد الالتصاق، تزحف العديد من الكريات البيضاء على السطح اللمعي ويبدو أنها تبحث عن الموقع الأمثل للانتقال عبر البطانة.

بعد ذلك، تتحرك الكريات البيضاء الزاحفة عبر البطانة الغشائية، وهي عملية تسمى الهجرة عبر البطانة الغشائية. بعد ذلك، تهاجر الخلايا المتعادلة في الأنسجة خارج الأوعية الدموية باتجاه مصدر الجاذب الكيميائي في موقع الالتهاب، وهي عملية تسمى الانجذاب الكيميائي MOIs. يوضح هذا الفيديو تجربة كيفية استخدام التصوير بالفيديو الحي المجهري بالمجال المضيء، والتصوير الزمني المتقطع، وبرنامج Image J لتصور وتتبع وتحديد الزحف داخل اللمعة للخلايا المتعادلة، والهجرة عبر البطانة الغشائية، والهجرة بالانجذاب الكيميائي في أنسجة العضلات، والاستجابة لمصدر الجاذب الكيميائي للخلايا المتعادلة.

مرحباً، أنا ليس ليو من قسم علم الأدوية بكلية الطب في جامعة ساسكاتشوان. سنوضح لكم اليوم كيفية تحضير تدرج جذب الخلايا المتعادلة الكيميائي في هلام الأغار، وكيفية تحضير عضلة الساق للفأر من أجل المجهر الحيوي.

كيفية تتبع حركة الخلايا باستخدام MEGJ. وأخيرًا، كيفية تحليل معايير تجنيد العدلات؛ سيقوم طالبان من الدراسات العليا في مختبرنا، ngel Naja و sh و Chile، بشرح الإجراءات التجريبية التفصيلية. مرحبًا، أنا Naja Sh. مرحبًا، أنا Chile.

لبدء هذه التجربة، قم بتحضير مادة جذب الخلايا المتعادلة كيميائياً في agro gel أولاً؛ اسحب بواسطة الماصة 10 milliliters من محلول PBS بتركيز ضعفين وضعه في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. قم بتدفئة الأنبوب بوضعه في دورق يحتوي على ماء ساخن. ثم اسحب بواسطة الماصة 10 milliliters من الماء المقطر.

أضف 0.4 غرام من مسحوق agar إلى أنبوب مخروطي آخر سعة 50 milliliter. سخن الخليط في فرن ميكروويف حتى الغليان لإنتاج محلول agar بتركيز 2% في PBS. أضف محلول PBS بتركيز ضعفين وهو دافئ إلى أنبوب محلول agar.

قم بتحريك المحلول المخلوط بلطف مع إبقائه دافئاً في كأسه الموجود في الحمام المائي الساخن. اخلط محلول الجذب الكيميائي جيداً مع 3 µL من حبر الهند (India Ink) في غطاء أنبوب εend سعة 1.5 mL. تجنب تكوين فقاعات هوائية أثناء عملية الخلط.

اقطع الطرف المدبب لطرف ماصة سعة 200 microliter واستخدم ماصة دقيقة. ضع 110 microliters من محلول agro عند درجة حرارة 42 degrees Celsius في الغطاء واخلطه جيداً على الفور. باستخدام طرف ماصة آخر، احفظ هذا الهلام المحتوي على الجاذب الكيميائي في الثلاجة حتى وقت الاستخدام. قم بتخدير فأر ذكر بالغ عن طريق حقن خليط من xylazine و ketamine في التجويف البريتوني (IP).

احلق المنطقة الموجودة فوق الوريد الوداجي الخارجي الأيمن والجانب الأمامي من كيس الصفن. باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية بعد التخدير، من المهم إيلاء اهتمام وعناية خاصين للفأر المخدر. يمكن استخدام مصباح حراري لمنع إصابة الفأر بانخفاض درجة حرارة الجسم.

يجب أن يكون الفأر خالياً من استجابة الألم الانعكاسية. قم بإجراء شق أفقي، ثم حدد الوريد الوداجي وقم بقسطرته باستخدام أنبوب PE 10 مملوء بمحلول ملحي يحتوي على heparin بتركيز 100 units per milliliter. قم بتوصيل اللوحة بدورة مياه بدرجة حرارة 37 degree Celsius للحفاظ على دفء العضلة المشمرة وجسم الفأر.

ثبّت القوائم الخلفية للفأر باستخدام أشرطة سرية مع وضع الفأر في وضعية الاستلقاء الظهري على لوحة عضلة الرافعة للخصية. قم بإجراء شق في جلد الصفن لكشف عضلة الرافعة للخصية اليسرى. ثم قم بتسليخ العضلة بعناية عن اللفافة المرتبطة بها.

قم بغمر العضلة الكريمسترية (cremaster muscle) بمحلول ملحي بيكربونات منظم مدفأ عند 37 درجة Celsius. اربط غرزة قياس 4.0 في الطرف القاصي للعضلة الكريمسترية لتثبيتها على القاعدة الزجاجية الشفافة للرؤية في لوحة العضلة الكريمسترية. قم بكي العضلة الكريمسترية طولياً باستخدام جهاز كي مع غرزة قياس 4.0.

ثبّت العضلة بشكل مسطح وأمّنها على طول الحواف فوق القاعدة. افصل الخصية والبربخ عن العضلة الموجودة تحتهما وانقلهما إلى التجويف البطني. أضف طبقة رقيقة من الشحم المفرغ (vacuum grease) إلى الحواف المتقابلة لغطاء شريحة زجاجية بمقاس 22 by 22 millimeter.

بعد ذلك، قم بتغطية العضلة المكشوفة بغطاء الشريحة الزجاجي. ضع لوحة العضلات الرئيسية على منصة المجهر. افحص العضلة تحت المجهر وابحث عن وريد ما بعد شعيري مناسب.

اختر الوريد الذي يتميز بمعدل قص طبيعي وقطر يتراوح بين 25 إلى 40 micrometers. اضبط كاميرا الفيديو بحيث يمكن رؤية الوريد في وضع عمودي على الطرف الأيمن أو الأيسر من شاشة التلفزيون. بعد 30 دقيقة، قم بتسجيل الصور المرئية للوريد المختار ما بعد الشعيري كبيانات تحكم أساسية باستخدام جهاز تسجيل فيديو مثل مسجل DVD.

هذه هي صور فيديو التحكم الأساسية للوريد ما بعد الشعيري. قبل وضع الهلام المحتوي على الجاذب الكيميائي على سطح العضلة الرافعة للخصية، أوقف عملية التروية السطحية وأزل غطاء الشريحة الزجاجية عن العضلة، ثم استخرج قطعة من الهلام المحتوي على الجاذب الكيميائي بحجم 1 mm³ من غطاء أنبوب إبندورف. باستخدام طرف مقطوع لرأس ماصة سعة 200 µL، ضع قطعة الهلام المحتوي على الجاذب الكيميائي المستخرجة على سطح العضلة الرافعة للخصية في منطقة محددة مسبقاً، على بُعد 350 µm من الوريد ما بعد الشعيري المرصود.

أضف غطاءً زجاجياً لتثبيت الهلام في مكانه، ثم قم بضخ نسيج العضلات بمعدل بطيء جداً، أقل من أو يساوي 10 µL في الدقيقة، للسماح بتكوين تدرج من الجاذب الكيميائي الذي يتم إطلاقه ببطء وتشكيله من الهلام. سجل الصور المرئية لمدة 90 دقيقة بعد إضافة الهلام المحتوي على الجاذب الكيميائي. وأثناء التسجيل، اضبط وحافظ على تركيز المجهر على كرات الدم البيضاء الملتصقة والزاحفة والمهاجرة عبر الأوعية والمتحركة كيميائياً داخل الوريد وفي نسيج العضلات.

بعد انتهاء التجربة، قم باستيراد ملف الفيديو إلى جهاز الكمبيوتر. ولإجراء التحليل على الكمبيوتر، استخرج الفيديو وحوله إلى تنسيق AVI. على سبيل المثال، استخدم برنامج الكمبيوتر المجاني bit ripper لتحويل فيديو DVD إلى ملف AVI.

استخدم برنامجاً لتحرير الفيديو، مثل windows movie maker، لإنشاء فيلم تسريع زمني (time-lapse) من الفيديو الأصلي المسجل بالوقت الفعلي، ثم قم بتحويل وحفظ فيلم التسريع الزمني بصيغة DV A VI. سجل صور الميكرومتر المعاير تحت نفس إعدادات المجهر، ثم استورد الصور إلى الكمبيوتر.

افتح الصور باستخدام برنامج Image J. قم بقياس حجم الشاشة على كِلا المحورين x و Y واحسب عدد البكسلات لكل ميكرومتر. لاستيراد المقطع المرئي، افتح برنامج Image J مرة أخرى، ثم انقر على file import باستخدام إضافة QuickTime movies، وحدد المقطع المرئي المراد تحليله، ثم انقر على okay في واجهة QT movie opener، ثم انقر على plugins. لتتبع الخلايا يدوياً، استخدم Manual tracking وقم بتعبئة المعلومات ذات الصلة في الحقول الموجودة أسفل الشاشة قبل البدء بالتتبع؛ ويجب تحديد المعلمات التالية قبل بدء التتبع الوقت.

يتم حساب الفاصل الزمني بالثواني عن طريق قسمة إجمالي الوقت المنقضي على 30، بينما يمثل معايرة xy قياس الميكرومتر لكل بكسل المستمد من معايرة صورة الميكرومتر، وتُضبط معايرة Z عند الصفر، أما حجم مربع البحث للتمركز فيساوي 1. ومن الضروري اختيار نقطة مستقرة وواضحة في الفيديو المسجل لتكون بمثابة نقطة مرجعية. ويمكن أن تكون هذه النقطة المرجعية أي نقطة تركيبية صغيرة وواضحة تظل ثابتة وغير متغيرة طوال التجربة بأكملها.

انقر على "إضافة مسار" (add track) لتتبع النقطة المرجعية من الإطار الأول إلى الإطار الأخير. ثم انقر وتتبع الخلايا المتعادلة (neutrophils) الزاحفة والمهاجرة واحدة تلو الأخرى. انقر على "إضافة مسار" (add track) لتتبع الخلية منذ ظهورها في النسيج حتى اختفائها في كل إطار.

بعد ذلك، انقر وقم بالتتبع للإنهاء وحفظ النتائج في برنامج Microsoft Excel. افتح ملف النتائج في برنامج Microsoft Excel، وابدأ في تحليل البيانات.

من المهم إدراج تحركات نقطة المرجعية في التحليل. عند تتبع زحف الخلايا المتعادلة والزحف اللمعي، نحدد مسافة الزحف للخلايا المتعادلة والزحف اللمعي وسرعة الزحف. وعند تحليل الهجرة عبر البطانية للخلايا المتعادلة، نقيس وقت الهجرة عبر البطانية للخلايا المتعادلة ووقت الانفصال.

عند تحديد الانجذاب الكيميائي للخلايا المتعادلة في أنسجة العضلات، نقوم بقياس مسافة وسرعة هجرة الخلايا المتعادلة وانجذابها الكيميائي في العضلة، كما نحدد مؤشر الانجذاب الكيميائي أثناء عملية الانجذاب الكيميائي للخلايا المتعادلة في أنسجة العضلات. تتوفر تعريفات هذه المعلمات المعروضة على الشاشة بالتفصيل في البروتوكول المكتوب الخاص بنا. ونستعرض في هذه التجربة إجراءات كيفية استخدام المجهر الحيوي ذو المجال المضيء لتصور وتحديد الزحف داخل اللمعة للخلايا المتعادلة، والهجرة عبر البطانية، والهجرة أثناء الانجذاب الكيميائي.

استجابةً للمواد الجاذبة للخلايا المتعادلة في الجسم الحي، استخدمنا إما MIP-2 أو CXCL2 أو الببتيد الاصطناعي W-K-Y-M-V-M الذي تم تحضيره في هلام الأجار لتحفيز تجنيد الخلايا المتعادلة في أنسجة عضلة CMA لدى الفأر. وكما يظهر في هذا الشكل، فإن MIP-2 بتركيز 0.5 µM و W-K-Y-M-V-M بتركيز 0.1 mM قد حفزا الزحف داخل اللمعة للخلايا المتعادلة بسرعات مماثلة. كما كانت الهجرة عبر البطانية للخلايا المتعادلة والانفصال عن الوريد متقاربة من حيث المدة الزمنية.

أدت هاتان المادتان الجاذبتان كيميائياً أيضاً إلى تحفيز هجرة الخلايا المتعادلة والانجذاب الكيميائي في الأنسجة العضلية بسرعة متقاربة تقريباً وبمؤشرات انجذاب كيميائي متشابهة للخلايا المتعادلة. ويعد المجهر الحيوي أداة قيمة للملاحظة المباشرة لعملية استقطاب الخلايا المتعادلة وللتحديد الكمي لوظائف الخلايا والجزيئات في كل خطوة من خطوات الاستقطاب. ومن خلال استخدام التصوير بالفيديو بنظام الفاصل الزمني وبرنامج Image J، يمكن قياس الزحف داخل اللمعة والهجرة عبر البطانة والهاجرة في الانجذاب الكيميائي لكريات الدم البيضاء والأنسجة تحت المجهر الحيوي بالمجال المضيء، وذلك باستخدام المثبطات الانتقائية، والفئران المعدلة وراثياً، والمواد الجاذبة كيميائياً الانتقائية.

يمكن لنظام المقايسة أن يساعدنا في الكشف عن وظائف بروتينات محددة في استقطاب الكريات البيضاء.