التصوير فرمون الاستشعار في الميكعي ماوس الحادة الأنسجة إعداد شريحة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير شرائح نسيجية حادة من العضو الأنفي الـ RO أو العضو الأنفي الغدي (VNO) للفأر، وذلك بهدف إجراء تجارب تصوير الكالسيوم على مجموعات فرعية و/أو عصبونات فردية في نسيج حي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استئصال الـ VNO من أنف الفأر، ثم تشريحه مجهرياً من كبسولته الغضروفية باستخدام مجهر تشريحي في سائل A CSF بارد. بعد ذلك، يتم وضع الـ VNO المعزول عمودياً في كتلة أغار، ثم تُقطع شرائح نسيجية إكليلية حادة باستخدام المقطاع المجهري (microtome) للتحقق من سلامة النسيج.

تتم ملاحظة بضع شرائح بعد إجراء الكيمياء النسيجية المناعية تحت مجهر بؤري. ويتم تحميل شرائح أخرى بصبغة حساسة للكالسيوم، ثم تُروى بليجاندات فيرومونية مفترضة، وتُلاحظ الاستثارة العصبية باستخدام تصوير الكالسيوم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في حل قضايا رئيسية في مجال الشم.

على سبيل المثال، يتم التعبير عن مئات من مستقبلات الفيرومونات في العضو الأنفي الرومي، ولكن القليل جداً منها يمتلك ربيطات محددة. ومن الصعب جداً التعبير عن مستقبلات الفيرومونات في نظام غير متجانس. لذا، كنا بحاجة إلى تطوير مقايسة فعالة داخل الجسم الحي لتعيين فيرومونات محددة لمستقبلات معينة.

يمكننا استخدام فئران tact حيث تعبر مجموعة فرعية محددة من الخلايا العصبية عن مستقبلات مجهولة ويمكن تحديدها من خلال تعبير GFP. كما يمكننا استخدام هذا الاختبار للبحث صيدلانياً في القنوات الأيونية والإنزيمات المشاركة في شلال نقل Fairmont لتوضيح الإجراء. سيكون معنا اليوم جوليان وفابيان، وهما باحثان من مختبري، قبل البدء في عملية التشريح.

قم بتحضير سائل دماغي شوكي اصطناعي طازج وبارد، CSF مشبع بـ oxy carb عن طريق خلط جميع المكونات باستثناء كلوريد الكالسيوم. قم بإشباع المحلول عن طريق تمرير فقاعات oxy carb فيه مباشرة. ثم أضف كلوريد الكالسيوم واضبط الحجم النهائي باستخدام ماء مقطر مزدوج حتى الوصول إلى الحجم المطلوب.

احتفظ بمحلول A CSF على الجليد حتى وقت الاستخدام. بعد القتل الرحيم وفصل رأس فأر بالغ، قم بتجهيز طبق بتري يحتوي على محلول A CSF بارد ومؤكسج ومكربن باستمرار. بعد إزالة الفك السفلي، ضع رأس الفأر في طبق بتري.

ضع رأس الفأر تحت مجهر التشريح من أجل رؤية الحنك. بعد ذلك، قم بإجراء شق أفقي في الجزء العلوي من الحنك باستخدام مقصات دقيقة، ثم قم بإزالة غشاء الحنك باستخدام ملقط تشريح دقيق. قم بترطيب وتنظيف التجويف المكشوف باستخدام A CSF.

قم بقص الجزء العلوي والسفلي من الحاجز الأنفي. ثم استخرج بعناية الحاجز الأنفي الذي يحتوي على VNO وضعه رأسيًا وبشكل مباشر في A CSF نظيف. افصل جزئي VNO باستخدام ملقط التشريح الدقيق.

حدد المحفظة الغضروفية للعضو الأنفي الملحق (VNO) ثم قم بإزالتها بعناية، مع التأكد من إزالة جميع القطع الغضروفية. يشار هنا إلى العضو الأنفي الملحق المعزول، والقطع الغضروفية، والعضو الأنفي الملحق غير المشرح أولاً؛ قم بتحضير آجار منخفض الانصهار بتركيز 3% ثم جهز مساحة العمل بالأدوات اللازمة. املأ قالب التثبيت بالآجار وتأكد من أن درجة الحرارة أقل من 41 °C قبل غمر العضو الأنفي الملحق المشرح. ضع النسيج بشكل عمودي من أجل الحصول على مقاطع إكليلية.

ضع قالب التضمين على الثلج لمدة دقيقة واحدة حتى يتصلب الآجار. بعد دقيقة واحدة، قم بإزالة كتلة الآجار، وقطّع الآجار إلى شكل شبه معدني، ثم ألصقه بدعامة الميكروتوم. استخدم الميكروتوم لقطع شرائح إكليلية من العضو الأنفي الحسي (VNO) بسرعة 0.5 millimeters per second، وسعة 0.7 millimeters، وبسمك 100 micrometers في سائل CSF بارد.

اجمع شرائح النسيج باستخدام فرشاة وضعها في طبق زراعة أنسجة مملوء بـ A CSF بارد من أجل التحقق من السلامة الهيكلية لشرائح النسيج المجمعة، حيث يمكن تثبيتها ثم إجراء صبغ مناعي لمكونات الهيكل الخلوي أو بروتينات أخرى ذات أهمية. هنا، يوضح الصبغ المناعي ضد acetylated tubulin باللون الأرجواني السلامة الهيكلية لشريحة النسيج. علاوة على ذلك، فإن ملاحظة مجموعة عصبونية محددة حيث تم وسم مستقبل فيروموني معين بواسطة GFP تظهر المورفولوجيا العصبونية المحفوظة؛ حيث يمكن ملاحظة عصبونات ذات أجسام خلوية بيضاوية صغيرة وتغصنات طويلة تصل إلى سطح التجويف وتنتهي بخملات دقيقة عند العمل في غرفة مظلمة.

يتم تحضين شرائح العصب الأنفي الحجاجي (VNO) في محلول تحميل من سائل CSF الاصطناعي البارد مع 7 µM من URA 2:00 AM و 0.1%onic لمدة ساعة واحدة عند 37 °C. بعد مرور ساعة، تُحفظ الشرائح المُحمَّلة على الثلج مع كربنة الأكسجين حتى وقت الاستخدام. تُستخدم فرشاة رسم لنقل الشرائح المُحمَّلة إلى غرفة تروية تحتوي على سائل A CSF، ثم تُثبت الشرائح باستخدام مثبت شرائح الأنسجة.

ضع غرفة التروية على منصة المجهر في إعداد تصوير الكالسيوم وقم بالتروية المستمرة بـ A CSF مكربن ومؤكسج في درجة حرارة الغرفة. افحص شرائح VNO المحملة باستخدام أطوال موجات الفلورية المقابلة للصبغة، وهي من 340 إلى 380 نانومتر لـ four O 2:00 AM. استخدم البرنامج المناسب لتسجيل التغيرات في نسبة الكالسيوم داخل الخلايا. يعد نظام التروية ضرورياً لتحفيز التحفيز الكيميائي.

هنا، يظهر مقطع إكليلي لأنسجة العضو الأنفي المساعدة (vno) من فأر حيث تعبر المجموعة الفرعية من العصبونات التي تعبر عن مستقبل الفيرومون V1R2 عن بروتين GFP أيضاً، وقد صُبغت مناعياً ضد بروتين التوبولين المفسفر (acetylated tubulin) الموضح باللون الأرجواني. وتُظهر المشاهد عالية التكبير للمقطع الحفاظ على سلامة الأنسجة. كما تظهر العصبونات ذات التغصنات الطويلة وهي تصل إلى سطح التجويف، ويمكن رؤية تعبير البروتين الهيكلي في العُقيدات التغصنية والخميلات الدقيقة المستخدمة للتصوير الكالسيومي.

يتم أولاً فحص شرائح الأنسجة المحملة بـ FU باستخدام تباين طور هوفمان لتحديد الحقل المطلوب بدءاً من الوعاء الدموي، السهم الأبيض الأول، حيث يتجه الملاحظ ببطء نحو اللمعة، السهم الأبيض الثاني، ومنطقة الظهارة العصبية. يمكن التعرف على جسم الخلية البيضاوي للعصب الأنفي RO، السهم الأبيض الثالث، من خلال استطالته ونحافة استطالته.

يشير السهم الأبيض الرابع الممتد إلى التجويف، وهو النتوء التشجري العصبي. ويحمل السهم الأبيض الخامس خملات دقيقة في حالة تلامس مع خلايا محملة بالفيرومونات RA، حيث تظهر هنا عند 380 nanometers، ثم يتم إضاءتها بالتتابع عند 340 و380 nanometers، وتتم معايرة نسبة طول الموجة الفلورية هذه بما يتوافق مع تغيرات الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا العصبية المختارة، الموضحة بالدوائر السوداء والحمراء والزرقاء. ويُستخدم TP لتحديد حيوية الخلايا العصبية.

لاحظ نطاق استجابات الكالسيوم التي ظهرت عبر الخلايا العصبية الثلاث المختارة، وحقيقة أن الخلية العصبية رقم اثنين المحاطة بدائرة حمراء لا تستجيب لـ TP، وبالتالي سيتم استبعادها من التحليلات اللاحقة. يتم بعد ذلك تحقيق التحفيز الكيميائي باستخدام كل من البول ومزيج من فيرومونات الفئران مع الفحص في عمق شريحة النسيج. ومن الممكن تحديد موقع مجموعة فرعية من الخلايا العصبية التي تعبر عن كل من GFP ومستقبل V1RR2.

يظهر هنا عصبون يعبر عن كل من GFP ومستقبل V1RB2 إلى جانب عصبون لا يعبر عن V1RB2. كلتا الخليتين محملتان بـ URA 2:00 AM، ويظهر العصبون المعبر عن V1RB2 طفرة في الكالسيوم استجابةً لتروية ربيطة المستقبل 2-hep known. ومن المثير للاهتمام أن العصبون الذي لا يعبر عن V1RB2 يستجيب أيضاً لـ 2-hep known، مما يوضح تعقيد ترميز الفيرومونات في VNO.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك فهم جيد لكيفية استئصال وعزل عضو خلية مار في الفأر مجهرياً من أجل تحضير شرائح نسيجية حادة. هذا البروتوكول قابل للتطبيق أيضاً في الاستقصاءات الفسيولوجية باستخدام صبغات كالسيوم بديلة وتجهيزات مجهرية مختلفة. بالتوفيق في تجربتك.