في الموقع التهجين لتوطين دقيقة من النصوص في النباتات

الهدف العام من التجربة التالية هو تصور أنماط تعبير mRNA على المستوى الخلوي بحساسية وخصوصية عاليتين. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال إخضاع مقاطع نسيجية مثبتة بالفورمالين والمدمجة في البارافين لسلسلة من المحاليل لإزالة الشمع ونفاذ الأنسجة وحجب المجموعات الثانوية موجبة الشحنة في الأنسجة التي قد تؤدي إلى ظهور إشارة خلفية. لاحقاً، يتم إدخال مسابير RNA موسومة بـ DIG وتكون نوعية للجين المستهدف في المقاطع النسيجية، ثم تُترك الشرائح للتهجين طوال الليل.

بعد ذلك، تُعالج الشرائح بـ RNAs. A لإزالة المسبار المرتبط بشكل غير محدد من المقاطع، ثم تُحضن مع جسم مضاد لـ DIG. وهذا يتيح تصور المسبار المهجن من خلال تفاعل كيميائي لوني.

تظهر النتائج إشارة زرقاء داكنة يمكن رصدها بواسطة المجهر الضوئي تحديداً في تلك الخلايا داخل النسيج التي يتم فيها التعبير عن الجين المستهدف. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بتحليلات التعبير الأخرى التي نجريها، مثل R-T-P-C-R، أو المصفوفات الدقيقة (microarray)، أو مناهج تسلسل الجيل التالي (Next Generation Sequencing)، في أن بروتوكول التهجين الموضعي (In Situ Hybridization) المعروض هنا يكشف عن نمط التعبير للجين المستهدف ضمن سياقه النسيجي. وتتضمن هذه الطرق العديد من الخطوات التي يُفضل تعلمها من خلال العروض المرئية.

سوف نوضح كيفية تقطيع وتضمين الأنسجة، بالإضافة إلى الخطوات الرئيسية في بروتوكول التهجين المتقاطع (Al Hybridization) التي يصعب إتقانها بشكل فردي. تختلف طريقة تضمين الأنسجة المثبتة بالبارالدهيد اعتماداً على نوع النسيج المراد تحليله. والنقطة الأكثر أهمية هنا هي ضمان توجيه العينات بشكل صحيح تمهيداً لعملية التقطيع لاحقاً.

تتمثل إحدى طرق التضمين في استخدام قوالب وحلقات بلاستيكية. لبدء هذا الإجراء، يتم تسخين القوالب على لوح تسخين بدرجة حرارة 60 °C، ثم يُصب البارافين المنصهر في القوالب. بعد ذلك، تُستخدم ملقط مُسخن لنقل عينة نسيجية إلى كل قالب وتوجيهها في الموضع المطلوب.

انقل القالب بعناية من الطبق إلى المنضدة وضع الحلقة البيضاء فوق القالب. أضف المزيد من الشمع. اترك الشمع ليبرد ويتصلب تدريجياً قبل البدء في عملية التقطيع.

قم بتدفئة القوالب حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم قم بتشذيب كل قالب إلى شكل شبه منحرف، مع ترك حوالي 1 mm من الشمع حول العينة. ضع القالب المشذب على الميكروتوم بحيث يكون الوجه الأطول من الوجهين المتوازيين في الأسفل. حرك القالب بعناية باتجاه الشفرة وتأكد من أن سطح القالب موازٍ لمقطع الشفرة.

بِسمك يتراوح من 8 إلى 10 ميكرون. قم بمحاذاة شرائط الشمع على سطح غير لاصق، مثل ورق الألمنيوم، وحدد المقاطع المراد دراستها باستخدام مجهر تشريحي. بعد ذلك، قم بتمييز شرائح prob bon plus باستخدام قلم رصاص.

تجنب استخدام الأقلام على العلامات لأنها ستُمحى أثناء بروتوكول التهجين المزدوج INI. قم بتوزيع 1 mL من مياه milli Q النظيفة على كل شريحة. ضع المقاطع المطلوبة بعناية لتطفو على سطح الماء في درجة حرارة الغرفة.

تأكد من أن الجانب اللامع مواجه للماء. انقل الشريحة ببطء إلى مسخن الشرائح. اضبط درجة الحرارة بين 35 و 37 درجة Celsius.

يمنع نطاق درجة الحرارة هذا، على عكس درجة حرارة 42 درجة مئوية الشائعة الاستخدام، تكون الفقاعات أسفل المقاطع. بعد خمس دقائق، اسكب الماء بعناية ولكن بحركة واحدة سلسة بحيث ينخفض الشريط فوق الشريحة. اترك الشرائح تجف لعدة ساعات على الأقل أو طوال الليل عند 37 درجة مئوية لضمان التصاق النسيج لتحضير مقاطع النسيج.

بالنسبة للتهجين الموضعي، يتم أولاً إزالة شمع البارافين وإعادة ترطيب العينات لإتمام عملية إزالة الشمع. تُحضن الشرائح في محلول xylene (Histiclear) مرتين لمدة 10 دقائق في كل مرة. ولإعادة ترطيب المقاطع النسيجية، تُمرر الشرائح عبر سلسلة من تركيزات الإيثانول المتناقصة لمدة 30 ثانية لكل تركيز.

أثناء المعالجة بالبروتياز، والتي لم تُعرض في هذا الفيديو، قم بتجهيز طبق زجاجي يحتوي على محلول triathlon amine بتركيز 0.1 molar وضعه على لوح تحريك داخل خزانة استخراج الغازات. وقبل وضع حامل الشرائح المعدني في المحلول مباشرة، أضف 1.25 milliliters من acetic anhydride إلى triathlon amine والمحلول المنظم والمحرك. بالإضافة إلى ذلك، قم بتجهيز نظام التثبيت والحامل المخصص للإمساك بحامل الشرائح.

قم بتقليل سرعة مشبك Starr، وثبّت حامل الشرائح على الحامل، ثم اخفض الحامل في المحلول مع إبقائه مرفوعاً فوق قضيب التحريك. استمر في التحريك ببطء لمدة 10 دقائق، وبعد ذلك يتم الشطف باستخدام PBS وإزالة الماء مرة أخرى عبر سلسلة من الإيثانول. تصبح قطاعات الأنسجة الآن جاهزة للتهجين.

ضع الشرائح على سطح نظيف واتركها لتجف تماماً في الهواء لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق. قم بتحضير خليط منظم تهجين المسبار عن طريق إضافة المسبار الممسوخ إلى 80 µL من منظم التهجين. وبالنسبة لكل شريحة، اخلط المزيج جيداً باستخدام الماصة، مع تجنب تكوين فقاعات.

قم بماصة منظم تهجين المسبار. امزجه على الحافة اليمنى للشريحة. أنزل غطاء الشريحة تدريجياً فوق الشريحة، مع التأكد من أن محلول التهجين يغطي جميع المقاطع دون وجود أي فقاعات.

انقر بخفة بإصبعك على غطاء الشريحة في المواضع التي تتكون فيها فقاعات لإزاحتها من جميع مقاطع الأنسجة. لا تقم بنزع غطاء الشريحة لأن ذلك سيؤدي إلى إتلاف المقاطع. ضع الشرائح في غرفة رطوبة تحتوي على ورق watman مبلل بماء UE ومغطى إلى حد كبير بـ param.

أغلق الصندوق بإحكام وقم بحضن الشرائح عند درجة حرارة التهجين المطلوبة، والتي تتراوح عادةً بين 50 إلى 55 درجة Celsius لمدة تتراوح من 16 إلى 20 ساعة. عند اكتمال بروتوكول التهجين، قم بإزالة أغطية الشرائح بعناية. قد يسقط غطاء الشريحة ببساطة عند وضع الشريحة في وضع عمودي، ولكن إذا لم يحدث ذلك، فلا تسحب الغطاء لأن هذا سيؤدي إلى إتلاف المقاطع.

بدلاً من ذلك، اغمر الشريحة في محلول SSC بتركيز 0.2 مرة دافئ لمدة دقيقة أو دقيقتين لغسل الغطاء الزجاجي؛ وبعد إزالة الأغطية الزجاجية، ضع الشرائح في حامل واغسلها عدة مرات في محلول SSC بتركيز 0.2 مرة عند درجة حرارة 55 درجة مئوية. بعد المعالجة بـ RNAs، انقل الشرائح من الحامل إلى قاع صندوق بلاستيكي مسطح وغطِّها بأقل حجم ممكن من محلول الحجب. احجب الشرائح لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على منصة هزازة بطيئة.

بعد ذلك، ضع حجماً أدنى من محلول الأجسام المضادة مباشرة على كل شريحة. احضن الشرائح في الظلام لمدة تتراوح بين ساعتين إلى ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة. وعند اكتمال عملية الحضن، انقل الشرائح إلى صندوق مسطح نظيف واغسل الشرائح أربع مرات باستخدام حجم أدنى من محلول الغسيل المنظم على منصة هزازة في درجة حرارة الغرفة.

اشطف الشرائح مرة واحدة في محلول TBS ومرتين في محلول TN المنظم، ثم ابدأ في وضع محلول التلوين المُحضّر حديثاً على الشرائح. أولاً، صب محلول التلوين في طبق وزن بلاستيكي صغير. بعد ذلك، ضع شريحتين فوق بعضهما بحيث تكون المقاطع متقابلة.

اغمس الشطيرة في المحلول، مع السماح للخاصية الشعرية بسحب المحلول إلى الأعلى. جفف الشرائح باستخدام منديل كيم (kim wipe). املأ الشرائح بمحلول التلوين.

مرة أخرى، قد يتطلب الأمر النقر على الشرائح أثناء تدفق المحلول لتجنب تكون الفقاعات، ثم توضع الشرائح في صندوق بلاستيكي وتُخزن في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. تظهر هنا نتائج نموذجية تم الحصول عليها باستخدام مجسات مختلفة وأنسجة من نبات arabidopsis. توفر الإشارة الأرجوانية تصوراً مباشراً بدقة خلوية لنمط تعبير الجين المستهدف.

يوضح اللوح A تموضع نسخ shoot Meli one في القمة النامية للساق الخضري. يُلاحظ وجود إشارة زرقاء أرجوانية في الجزء غير المحدد من الميرستيم وغياب الإشارة في الأوراق المحيطة. الألواح B 2D هي مقاطع عرضية لأجنة نبات arabidopsis في مرحلة طور الطوربيد، حيث يظهر اللوح B تعبير covata three في عدد قليل من الخلايا الجذعية الجنينية.

يُظهر الشكل C تعبيراً لـ T ML one في الطبقة البشرية، بينما يُظهر الشكل D غياب الإشارة في المقاطع التي تم فحصها باستخدام RNA ضابط سلبي عشوائي. وتُظهر الصور التالية النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام مجسات مختلفة على أنسجة الذرة. يوضح اللوح E تموضع STM Humalog knotted one في جنين الذرة النامي.

لاحظ أن الإشارة القوية تحديداً في المقاطع الطولية لساق وجذر الجنين عبر قمة النبتة الخضرية تُظهر أن ARF three A يُعبر عنه على السطح السفلي المحوري للورقة في اللوحة F، وأن homolog OCL four لـ A T ML one يُعبر عنه تحديداً في البشرة في اللوحة G. وكما كان متوقعاً، لم تُلاحظ أي إشارة تهجين للمسبار الضابط السلبي في اللوحة H. وتظهر هنا النتائج المتوقعة لنقاط التحقق المختلفة أثناء النسخ المختبري للمسابير. يتم فحص مسابير التهجين الموضعي على هلام ARAZ قياسي بعد النسخ المختبري، وبعد معالجة DNA والتنقية اللاحقة لتفاعل النسخ المختبري، وبعد التحلل الكربوناتي؛ وعندما تصبح المسابير التي يتجاوز طولها 250 base pairs جاهزة للاستخدام مثل المسبار 1، فإن التحلل الكربوناتي سينتج مجموعة من شظايا المسابير الأصغر حجماً.

يوضح هذا الشكل نتائج التأهيل اللوني والمقاييس للمجسات عن طريق تحليل لطخة النقطة (dot blot)، حيث تم استخدام تخفيفات تتراوح من 10⁻¹ إلى 10⁻⁵ لمجس تحكم بتركيز 100 nanogram per microliter وثلاثة مجسات حديثة موسومة بـ DIG؛ وقد وُضعت هذه المجسات على غشاء نقل تم تحضينه مع جسم مضاد لـ DIG ومحلول تحليل. ويشير التحليل إلى تركيز تقديري يبلغ 100 nanograms per microliter للمجس الثاني، و10 nanograms per microliter للمجس الثالث، و1 nanogram per microliter للمجس الرابع، مما يشير إلى أنه من غير المرجح أن يعطي المجس الرابع إشارة تهجين جيدة. وأخيراً، توفر هذه المقاطع الطولية عبر قمة النبتة الخضرية من Mace مقارنة بين إشارة خلفية غير محددة ولوحة مجسات تعمل بشكل جيد.

تُظهر الصورة A إشارة خلفية غير محددة، بينما تُظهر اللوحة B إشارة تهجين موضعي ثنائية محددة للمسبار OC five في طبقة الخلايا الخارجية. بعد مشاهدة هذا، يجب أن يكون لديك تصور جيد عن كيفية تنفيذ العديد من الخطوات الدقيقة في بروتوكولات التهجين الموضعي بحيث يمكنك تحديد أنماط التعبير الزمني والمكاني الدقيقة لجيناتك المفضلة.