كشف متعددة من البكتيريا الموجودة في مجمع العينات السريرية والبيئية باستخدام قليل النوكليوتيد ، بالإضافة نيون المجهرية

مرحباً، أنا تيم دوسو من وزارة الزراعة والأغذية الزراعية الكندية. سنقوم في هذا الفيديو بشرح بروتوكول لتحديد وجود ووفرة كائنات مجهرية محددة في عينة سريرية أو بيئية معقدة باستخدام جهاز bio plex. يستخدم هذا البروتوكول حبيبات بوليستيرين فلورية مرتبطة كيميائياً بمسبار قليلة النوكليوتيد خاص بنوع محدد.

يتم إنتاج قطعة مضخمة (amplicon) من العينة باستخدام بادئات PCR عامة، ثم يتم تهجين هذه القطعة المضخمة مع حبيبات مرتبطة بالمسبار. ويقوم جهاز bio plex بتوليد إشارتين؛ إحداهما تحدد هوية الحبيبة، والأخرى تقيس كمية إشارة التهجين.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد ملف تعريف للميكروبيوم المستهدف بطريقة سريعة وشبه كمية. لقد طبقنا هذه التقنية لتحديد الملفات التعريفية البكتيرية في مسحات المهبل واستخدام البيانات الناتجة لتشخيص داء التهاب المهبل البكتيري، وهو حالة سريرية تتميز بتغير في الميكروبيوم، حيث تصبح كائنات lactobacillus أقل انتشاراً وتصبح كائنات أخرى مثل Gardnerella و vais و apoian vae قابلة للكشف في مسحات المهبل. ومع ذلك، من المهم أن نتذكر أن هذه التقنية يمكن تطبيقها على أي ميكروبيوم آخر يكون فيه إجراء اختبار متعدد سريع مطلوباً.

لنبدأ بوصف كيفية عمل الإجراء. يتم إنشاء ملف تعريف ميكروبي عن طريق تضخيم بروتين ومرافق جين الغلاف في 60 من جميع الكائنات الحية الموجودة في مستخلص DNA من المسحة. يتم تعديل أحد بادئات التضخيم العالمية عن طريق إضافة البيوتين، بالإضافة إلى تضمين قواعد معدلة بالفوسفات.

عند الطرف '5، يتم تحويل ناتج التضاعف (amplicon) إلى شريط مفرد باستخدام إنزيم T7 exonuclease، الذي يقوم بتكسير الشريط المتمم (antisense strand) فقط. وبما أن الشريط ذو الاتجاه نفسه (sense strand) محمي بواسطة بادئ PCR معدل بالفوسفات، فإن المسابير قليلة النوكليوتيدات (oligonucleotide probes) المتممة للشريط المتبقي يتم ربطها تساهمياً بخرزات بوليسترين فلورية. ونظراً لأن كل لون فريد من الخرزات يحتوي على مسبار يكشف عن كائن حي مختلف، يمكن استخدام ما يصل إلى مائة خرزة مختلفة للعينة الواحدة.

يتم تهجين ناتج PCR أحادي السلسلة المستخلص من مسحة المهبل مع خليط خرزات مقترنة بمجسات تحتوي على مجسات لجميع الكائنات الحية ذات الصلة. ثم يُضاف كاشف فلوري FICO ethin يرتبط بالمجسات المبيوتنة عبر مقترن strep din. وفي النهاية، يتم تحليل خليط التهجين باستخدام جهاز luminex أو bio plex، والذي يفحص كل خرزة بشكل فردي لتحديد هويتها وإشارة التهجين.

تشير نتائج هذا التحليل إلى وجود كائنات مجهرية محددة، وتتناسب شدة إشارة التهجين مع وفرة ذلك الكائن. وفي العينة، يمكن استخدام وجود الكائنات المرتبطة بـ BV لتشخيص bv. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل صبغة غرام، في أنها تولد معلومات حول وجود كائنات مجهرية محددة ومدى وفرتها.

ستقوم جينيفر تاون، المساعدة البحثية في مختبرنا، باستعراض الإجراء. أعد تعليق الكرات الدقيقة عن طريق المزج الدوامي لمدة 20 ثانية تقريباً. انقل 400 µL من الكرات الدقيقة إلى أنبوب طرد مركزي من نوع إيبندورف، ثم قم بالطرد المركزي عند 14,000 ×g لمدة دقيقة واحدة، ثم قم بإزالة السائل العلوي والتخلص منه. أعد تعليق الكرات الدقيقة في 50 µL من محلول MES بتركيز 0.1 M و pH 4.5.

أضف كمية واحدة من أوليجو الالتقاط (capture oligo) إلى الكرات المجهرية وامزجها باستخدام جهاز الرج (vortexing). أضف 2.5 µL من محلول EDC الطازج إلى الكرات المجهرية. حضن التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام.

تخلص من محلول EDC الذي تم تحضيره سابقاً، وقم بتحضير عينة جديدة بتركيز 10 mg/mL من EDC في الماء. كما سبق، أضف 2.5 µL أخرى من محلول EDC الجديد إلى الكريات الدقيقة (microspheres) وقم بالخلط باستخدام جهاز الفورتكس لمدة خمس ثوانٍ. حضن العينة مرة أخرى في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام.

اغسل الخرزات بإضافة 1 mL من 0.02%Tween 20، واستخدم جهاز الـ vortex لإعادة تعليق الخرزات، ثم قم بالطرد المركزي عند 14,000 ×g لمدة دقيقة واحدة، ثم قم بإزالة السائل الطافي والتخلص منه. اغسل الخرزات مرة أخرى بإضافة 1 mL من 0.1%SDS. علّق الخرزات في 100 µL من منظم te.

قم بعدّ الخرزات باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer) لتحديد التركيز المخزون. قم بتحضير مزيج رئيسي من الكرات الدقيقة عن طريق تخفيف كل نوع من الخرزات إلى تركيز نهائي قدره 100 beads per µL في محلول التخزين المنظم (TE buffer)، ثم قم بتجميع الخرزات المقترنة وفقاً لعدد المؤشرات (plex) المطلوبة للمقايسة. احفظ المزيج الرئيسي للكرات الدقيقة عند درجة حرارة 4 °C في الظلام. يمكن تخزين هذا المزيج لعدة أشهر إذا تم الحفاظ عليه في هذه الظروف، ثم قم بتوليد ناتج PCR لكل عينة.

أضف مجموعة البادئات المعدلة بالفوسفات والبيوتين عند الطرف الخامس فور اكتمال عملية PCR. أضف 2 µL من T7 exonuclease إلى كل أنبوب PCR واحضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة. في نهاية هذه الحضنة، أضف 12.5 µL من EDTA بتركيز 0.5 M وبقيمة pH 8.0 إلى الخليط.

يعطي هذا إجمالي حوالي 64.5 µL من ناتج PCR أحادي السلسلة. قم بإعادة تعليق المزيج الرئيسي لـ Resus Bend Microsphere باستخدام ماصة، ثم صب كمية مناسبة منه في أنبوب إبيلدور.

أغلق الأنبوب بإحكام وقم بإجراء عملية السونكة (sonication) في حمام مائي مخصص للسونكة لمدة دقيقتين. قم بتوزيع 17 µL من ناتج PCR أحادي السلسلة في الآبار المناسبة من طبق 96 بئراً منخفض الارتفاع، ثم أضف 33 µL من خليط حبيبات السونكة المعاد تعليقها إلى كل بئر.

قم بتغطية الطبق بغطاء سيليكون ثم انقر عليه خفيفاً. ضع الطبق بحذر في جهاز التدوير الحراري (thermocycler) مع ضبط البرنامج على 95 درجة لمدة خمس دقائق، ثم 60 درجة لمدة 10 دقائق، ثم تثبيت أو إيقاف مؤقت عند 60 درجة لمدة خمس دقائق. النهاية، ابدأ البرنامج.

قم بتحضير محلول strep Aden FICO Ethin طازج. ستحتاج إلى 25 µL لكل بئر. قم بتحضير strep و FICO ethin عن طريق تخفيف الساق بتركيز 1 mg/mL.

بتركيز 1 من 50 إلى 20 micrograms per milliliter باستخدام 1x tmac buffer. عندما يصل جهاز التدوير الحراري (Thermocycler) إلى خطوة التثبيت عند 60 degrees، افتح الغطاء، وأزل الغطاء السيليكوني وأضف محلول strep din FICO ethin مباشرة إلى كل بئر. استبدل الغطاء السيليكوني وأغلق غطاء جهاز التدوير الحراري واستأنف البرنامج.

عند اكتمال البرنامج، أخرج الطبق وانقله بسرعة إلى جهاز bio plex للقراءة. يجب قراءة الطبق في غضون 10 دقائق. اقرأ الطبق عند درجة حرارة 60 °C.

تأكد من تسخين جهاز bio plex مسبقاً إلى هذه درجة الحرارة. يوضح هذا نتائج صبغات جرام المقابلة وملفات luminex للعينات الطولية المأخوذة من فرد واحد عند الزمن صفر. تتفق صبغة جرام مع التشخيص السريري لـ bv، وهذا ما يؤكده مقايسة Fiveplex Luminex التي تظهر إشارات تهجين إيجابية للكائنات المرتبطة بـ BV، بما في ذلك Gardner Relic و vais و Apoian Vae.

يتم الكشف عن Lactobacillus Iners أيضاً بمستويات منخفضة مع مرور الوقت. وينتقل هذا الفرد من ميكروبيوم مصاب بالتهاب المهبل البكتيري (BV) إلى ميكروبيوم طبيعي كما تظهر صبغات غرام. ويظهر تحليل Luminex لهذه العينات نفسها أن وفرة Gardnerella Vaginalis تصل إلى ذروتها ثم تتضاءل، بينما تزداد Lactobacillus Iners لتصبح الكائن المهيمن عند النقطة الزمنية النهائية.

تُستخدم هذه الطريقة في تحليل الميكروبيوتا لتوليد معلومات حول وجود كائنات حية محددة بالإضافة إلى مدى وفرتها. وبما أن هذه الطريقة تعتمد على التسلسل، يمكن الاسترشاد بتحليلات التسلسل العميق عند تصميم المجسات، كما يمكن تتبع الكائنات الدقيقة التي تم تحديدها بواسطة طرق تسلسل الجيل القادم في العينات بطريقة سريعة ومنخفضة التكلفة نسبيًا. ومن شأن مشاهدة هذا الفيديو أن تمنحك فهمًا جيدًا لكيفية إنشاء ملف تعريف ميكروبي من عينة باستخدام جهاز Luminex أو Bio Plex.

لقد أوضحنا لكم كيفية ربط مسابير قليلة النوكليوتيد بالخرزات الفلورية، وتوليد أحماض نووية أحادية السلسلة من عينة سريرية أو بيئية، وإجراء عملية التهجين، وتحديد النتائج باستخدام جهاز Luminex أو Bio Plex. نتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.