تصور انواع معينة ايليجانس استخدام الصبغة الحيوية محبة للدهون ، صلاح الغيدان

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير القشيرة في ديدان sea elegance الحية والشفافة باستخدام صبغة dye eye الشحمية الحمراء الفلورية. يتم تحقيق ذلك من خلال تحضير مجموعة من النيماتودا للتلوين، ثم تُضاف صبغة dye eye المخففة إلى هذه المجموعة وتُترك لتتحضن.

بعد ذلك، يتم استخراج الحيوانات من محلول الصبغ. ويظهر التصوير الفلوري للكيوتيكل المصبوغ بـ Dai تفاصيل السطح، بما في ذلك الهياكل التناسلية لـ Ailey وAnn eye وغيرها من السمات المورفولوجية الخارجية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية لتصوير الكيوتيكل في هذا الكائن الشفاف، مثل التصوير المباشر، والفلورة، والتعبير عن الجينات المنقولة، والصبغ بالأجسام المضادة، والمجهر الإلكتروني، وجلوتينين القمح المسمى، في أن هذه التقنية سهلة التنفيذ وسريعة نسبيًا وغير مكلفة، وتوفر دقة عالية للهياكل الكيوتيكلية في الحيوانات الحية.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في العديد من المجالات التي تستخدم نظام نموذج *C. elegans* وقشيرته، مثل إفراز الخلايا وتنظيم القشيرة، وتطور الخلايا البشرية، ومسارات الجينات ذات التوقيت المتباين، والمناعة الفطرية، وتطور السمات المورفولوجية وتطور النيماتودا. سيقوم روبي شولتز، وهو طالب دراسات عليا من مختبري، باستعراض الإجراء. عند العمل مع D Eye، ضع في اعتبارك أنه حساس للضوء.

يجب دائمًا حماية D eye من الضوء عن طريق لفه بورق القصدير. كما يجب ارتداء القفازات ومعطف المختبر لأن DMF مادة سامة و DAI مادة مسرطنة. إن Cyanide Dai قوي جدًا.

يبلغ تركيز التخفيف العامل القياسي 30 µg/mL من DII في M nine، وتتطلب المجموعة السكانية الواحدة 400 µL فقط من التخفيف العامل. ابدأ باستخدام طبق قطر 60 mm مستعمر بنيماتودا غير ملوثة. اغسل الحيوانات من الطبق في 1.5 mL من 0.5% Triton X 100.

في محلول M nine المنظم، قم بتحريك السائل بلطف في حركات دائرية لتحرير جميع الحيوانات اليرقية والبالغة، ثم انقل سائل الغسل إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. قم فوراً بطرد مركزي للحيوانات بسرعة 2000 RRP M لمدة 30 ثانية لتجميع الحيوانات في قاع الأنبوب. تخلص من أكبر قدر ممكن من السائل الطافي دون تحريك الحيوانات.

يجب توخي الحذر وعدم المبالغة في الكمية. اغسل الحيوانات باستخدام 1 mL من M nine. ثم قم بالطرد المركزي وإزالة الطافي.

كرر عملية الغسل. قم بالطرد المركزي مرة أخرى وأزل السائل الطافي. بعد ذلك، أضف 400 µL من 30 µg/mL من Dai في M nine إلى الأنبوب.

قم برج الأنبوب باستخدام جهاز الخلط الدوامي (Vortex) لفترة وجيزة لإعادة تعليق الحيوانات. بعد ذلك، قم برج الأنبوب عند درجة حرارة 20 °C في وضع أفقي لمدة تتراوح من 3 إلى 16 ساعة وبسرعة 350 RPM في بيئة محمية من الضوء. إن توقيت هذه الخطوات القليلة الماضية أمر بالغ الأهمية.

أولاً، يجب غسل Triton X قبل أن يقوم بإزالة الدهون التي يرتبط بها الصبغ. ثانياً، يجب صبغ الحيوانات في محلول صبغ العين لفترة كافية للسماح بصبغ القشيرة بشكل متجانس. وبعد ذلك بفترة وجيزة، ينبغي ترك الحيوانات تتعافى على الغذاء لفترة كافية لإزالة الصبغ غير المرتبط.

عند انتهاء عملية الصبغ، قم بطرد الحيوانات مركزياً لترسيبها ثم أزل محلول الصبغة. اغسل الحيوانات باستخدام 1 mL من M9. ولإزالة الصبغة غير المرتبطة، قم بطرد الحيوانات مركزياً ثم أزل السائل الطافي.

أعد تعليق الحيوانات في 400 µL من محلول M9 المنظم، ثم صبها على جزء خالٍ من البكتيريا في طبق NGM صغير. بعد الاستزراع ببكتيريا OP 50 E Coli، اترك الحيوانات لتتعافى في الظلام لمدة 30 دقيقة على الأقل، على ألا تتجاوز هذه المدة يوماً واحداً لأن فلورة الصبغة تخبو خلال فترة التعافي. يجب أن تزحف الحيوانات بعيداً عن السائل المصبوغ باتجاه الغذاء.

تعد هذه الحيوانات أسهل في التصوير نظراً لقلة الفلورة الخلفية الناتجة عن الصبغة الحرة في العين. ابدأ بتحضير وسادة أغار (agri pad) على شريحة، ولضمان توحيد سمك وسادة الأغار المستخدمة، استعن بفاصلين.

يتم صنع الفاصل عن طريق وضع قطعتين من الشريط اللاصق المختبري في طبقات على شريحة زجاجية. ويمكن استخدام الفواصل إلى مالانهاية. بعد ذلك، يتم وضع شريحة زجاجية نظيفة بشكل طولي بين شريحتين فاصلتين، ثم تُنقل حوالي 150 µl من Agar المصهور باستخدام الماصة.

على مركز الشريحة الزجاجية النظيفة. غطِّ AER المنصهر بسرعة بشريحة إضافية توضع بشكل عمودي فوق AER والفاصلين لتشكيل وسادة آغار. قم بإزالة شريحة التغطية بحذر، مع الحفاظ على توسيط الوسادة في الجزء العلوي من شريحة التثبيت.

الآن، قم بسحب خمسة ميكرولتر (5 µL) من المخدر الخاص بالديدان الخيطية باستخدام الماصة وضعها على منصة التثبيت، ثم ثبّت من 8 إلى 12 حيواناً في المخدر وغطِّها برفق بغطاء شريحة مجهرية. افحص الحيوانات باستخدام مجهر مركب أو مجهر بؤري (confocal) مزود بعدسة شيئية بقوة 40x على الأقل ومرشح TRITC أو أي مرشح آخر متوافق. يبلغ الحد الأقصى للإثارة الفلورية لصبغة dye eye‏ 549 nanometers، بينما يبلغ الحد الأقصى لانبعاثها 565 nanometers.

تُعد عملية التصوير في حالة الأصباغ المرتبطة الجزء الأكثر تحدياً في هذا البروتوكول. نحن نوضح كيفية تثبيت الحيوانات بغرض التصوير، ولكن يجب أن تكون مدرباً بشكل صحيح على المجهر المركب أو المجهر البؤري (confocal scope) الذي ستستخدمه. وقد وجدنا أن استخدام عدسة شيئية بتكبير 60x على الأقل هو الأفضل لتحليل التفاصيل التي تظهرها طريقة التصبيغ.

تم التقاط كل صورة في هذا القسم باستخدام عدسة شيئية بقوة 63x في مرحلة ما بعد الجنين لـ C elegans. يحتوي سطح القشيرة على حلقات مفصولة سنوياً بأخاديد محيطية، وفي بعض المراحل توجد حواف طولية تسمى ailey. تم التقاط كل صورة في هذا القسم باستخدام عدسة شيئية بقوة 63x في مرحلة ما بعد الجنين لـ C elegans.

يحتوي سطح الكيوتيكل على حلقات تفصل بينها أخاديد محيطية، وفي بعض المراحل توجد حواف طولية تسمى aley. تمتلك كل مرحلة نمائية تراكيب كيوتيكل ذات تركيبات وأنماط مميزة، حيث يتم صبغ الحواف أو الأخاديد الخاصة بـ aley و Aly فلوريسنتياً بناءً على تكوين السطح.

خلال جميع مراحل اليرقات والبالغين باستخدام طريقة الصبغ هذه، تظل هذه الأجزاء مرئية لمدة تصل إلى يوم واحد بعد الاستعادة. تُلاحظ أحياناً بقع فلورية في الخلفية ولكن ليس بشكل روتيني. يمثل هذا جلد الحيوانات البالغة الطافرة التي تظهر عيوباً متوسطة في تنظيم الجلد.

تكون تضالعات أيلي (Ailey ridges) غير متصلة وفائضة العدد. تكون تضالعات أيلي ملتحمة ومتفرعة أو متشعبة، وهي واسم انتقالي شائع. يتسبب أليل roll six السائد في التواء القشيرة، وهو ما يمكن ملاحظته في أيلي وقد يؤدي إلى جعل الحلقات ذات نمط غير منتظم.

يصبغ صبغ Dai أيضًا تراكيب أخرى من القشيرة الخارجية، بما في ذلك الخنثى البالغة، والفرج، ورفع الذيل ومروحة الذيل لدى الذكور البالغين؛ كما يمكن لصبغ Dai أن يبرز العيوب الطفيفة في المورفولوجيا الخارجية مثل هذا الذيل المتشعب. ومن الأمثلة على ذلك أن الصبغ لمدة ساعتين يؤدي إلى صبغ غير متجانس للقشيرة، على الرغم من أن العصبونات المعرضة للبيئة الخارجية قد تُصبغ. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون أربع ساعات، لا يشمل ذلك وقت التصوير، وذلك إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية صبغ sea elegance باستخدام صبغ dai لملاحظة القشيرة والتراكيب المورفولوجية الخارجية الأخرى.