الإنتاجية العالية للبروتينات غشاء البلورة باستخدام أسلوب Bicelle Lipidic

سيوضح هذا الفيديو طريقة لإعداد تجارب بلورة عالية الإنتاجية لبروتينات غشائية منقاة باستخدام خلايا Lipic B. أولاً، يتم تحضير خلايا B عن طريق خلط ليبيد ومادة منظفة، ثم يتم دمج البروتين الغشائي المنقى في خليط خلايا B، وتُجرى تجارب البلورة باستخدام روبوت النانوليتر. ويكشف الفحص البصري باستخدام مجهر ضوئي قياسي عن وجود البلورات.

بمجرد تشكّلها، يمكن استخلاص بلورات البروتين وتجميدها من أجل جمع البيانات وتحديد البنية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنه نظراً لسلوك الطور الفريد لخلايا B، يمكن استخدام المعدات والروبوتات القياسية المتوفرة في المختبر لعملية البلورة. يُعد إعداد خلايا B تقنية بسيطة تتيح لك إخراج بروتين الغشاء المستهدف من خلية المنظف، ووضعه في وسط دهني.

يمنحك هذا مجموعة جديدة تماماً من الظروف التي يمكن فحصها. إنها طريقة بسيطة للغاية تم استخدامها بنجاح على العديد من البروتينات الغشائية، لذا لا يوجد سبب لعدم تجربتها. تتمثل الخطوة الأولى في التبلور القائم على الخلايا البائية في تحضير خليط أمفيباتيك دهني يشكل خلايا بائية.

تتطلب هذه العملية جهداً كبيراً وهي الأكثر استهلاكاً للوقت. يرجى ملاحظة أنها قد تستغرق عدة ساعات حتى تكتمل. يمكن أن تتشكل خلايا B في مجموعة متنوعة من تركيبات الليبيدات الأمفيباتيكية وعبر نطاق واسع من التركيزات.

للحصول على نقاط البداية المقترحة، راجع الجدول رقم واحد في البروتوكول المكتوب المرفق؛ ابدأ بتحضير 1 mL من خليط DMPC و Chapo بتركيز 35% وبنسبة مولارية 2.8 إلى 1. وللقيام بذلك، قم بوزن 0.26 g من DMPC و 0.09 g من Chapo في أنبوب. أكمل الحجم ليصل إلى 1.0 mL باستخدام الماء منزوع الأيونات، ثم قم برج الخليط باستخدام جهاز vortex.

بعد ذلك، قم بتدفئة الخليط إلى حوالي 40 °C في حمام مائي حتى يصبح قوامه شبيهاً بالهلام. ثم ضع الأنبوب على الثلج، حيث يجب أن تعود العينة إلى الحالة السائلة مرة أخرى.

ثم استخدم جهاز الرج vortex مرة أخرى لبضع دقائق، واستمر في تكرار دورات التسخين والتبريد والرج حتى يذوب الليبيد تماماً. لاحظ أنه مع زيادة عدد الدورات، قد يصبح الخليط عكراً عند التبريد عند الانتهاء. سيكون الخليط على شكل هلام شفاف في درجة حرارة الغرفة أو أعلى منها، وسيكون سائلًا لزجًا على الثلج، ويمكن وضع الخلايا في درجة حرارة -20 °C للتخزين طويل الأمد.

بعد ذلك، يتم دمج البروتينات المنقاة في وسط الخلايا البائية. هذه عملية بسيطة ويجب إجراؤها في نفس يوم عملية البلورة، والتي سيتم عرضها في القسم التالي من الفيديو. قم بإذابة خليط خلايا B ذات غطاء DMPC في درجة حرارة الغرفة حتى تتغير الطور إلى هلام شفاف.

ضع الخليط على الثلج لتسييله، ثم قم برجّه لفترة وجيزة باستخدام جهاز vortext لإعادة إنشاء طور متجانس من الخلايا البائية (B cell). ومن هذه النقطة فصاعداً، احتفظ بخليط الخلايا البائية والبروتين المنقى على الثلج؛ حيث سيحافظ ذلك على الخلايا البائية في طور سائل، مما يجعلها قابلة للسحب بواسطة الماصة.

بعد ذلك، أضف خليط الخلايا البائية B cell إلى البروتين المذاب في المنظف المنقى بنسبة واحد إلى أربعة، حجماً إلى حجم. ثم قم بسحب المحلول وطرده بلطف باستخدام الماصة حتى يصبح المحلول صافياً ومتجانساً. وفي حال ظهور فقاعات، قم بتدويرها لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي مكتبي.

حضّن الخليط على الثلج لمدة 30 دقيقة على الأقل لتعزيز دمج البروتين بشكل كامل داخل الخلايا. أصبح خليط البروتين والخلايا الآن جاهزاً لتجارب البلورة. سيتم استعراض تجارب البلورة باستخدام روبوت البلورة mosquito.

قم بتبريد طبق ذو قاع على شكل حرف V وبـ 96 بئراً عبر وضعه على الثلج. قم بنقل خليط البروتين والخلايا إلى الطبق باستخدام الماصة لضمان تقليل لزوجة المحلول إلى أدنى حد. احتفظ بخليط البروتين والخلايا على الثلج حتى الخطوة النهائية.

يحتوي الروبوت المستخدم هنا على خمس منصات. ضع الطبق الدقيق الذي يحتوي على الخزان على المنصة الثالثة، وغطاء البلورة الذي ستُوزع عليه القطرات على المنصة الخامسة. ثم ضع طبق البروتين المستخلص من الخلايا على المنصة الرابعة الأقرب إلى موضع التوزيع.

يضمن ذلك أن يكون خليط البروتين والخلايا هو آخر ما يلتقطه الروبوت ليتم إطلاقه فوراً. باستخدام البرنامج، ابدأ التشغيل، حيث سيقوم الروبوت بالتقاط محلول الخزان يليه خليط البروتين والخلايا، ثم يتم توزيعهما على الغطاء في شكل قطرات لمنع التسخين وزيادة اللزوجة أثناء التوزيع. لا تقم ببرمجة جهاز mosquito لخلط محلول الخزان مع خليط البروتين والخلايا فور اكتمال التشغيل.

أخرج لوحة بروتين الخلايا المشتراة من الجهاز وضعها على الثلج. قم بإزالة الغطاء من الجهاز وضعه على اللوحة التي تحتوي على محلول الخزان بحيث تكون القطرات مقلوبة. قم بتحضين اللوحة عند 20 °C.

لاحظ أنه يمكن أيضاً اختبار درجات حرارة أخرى لتكوين البلورات وتحسينها. تحفز درجات الحرارة المرتفعة الطور الصفائحي، والذي يتميز بميزة التنظيم المسبق للبروتين في طبقات. يمكن فحص درجات الحرارة التي تتراوح بين 4 °C و 20 °C.

قد تؤدي درجات الحرارة التي تقل عن 4 °C إلى ترسب الدهون على مدى فترات زمنية طويلة؛ لذا قم بتقييم مظهر البلورات ونموها في اليوم الأول، والثالث، وأسبوعياً بعد ذلك، باستخدام مجهر ضوئي قياسي. تظهر هنا صورة بمجال ساطع وصورة بالأشعة فوق البنفسجية لبلورات إبرية الشكل لوحظت في حالة التعرض للهجوم فقط. لم يتم اكتشاف فلورة من البلورات، مما يشير إلى وجود نتيجة إيجابية كاذبة في هذه الصورة.

بلورة عصوية الشكل تكونت عند استخدام ميثيل بروبان ديول كعامل تريبس. تظهر البلورة فلورة ضعيفة مما يشير إلى أنها قد تكون بلورة بروتينية، ولكن تبين أنها غير بروتينية باستخدام حيود الأشعة السينية. يظهر هنا بلورة لوحظت بعد حوالي أربعة أسابيع من إعداد التجارب.

يؤكد الفلورة القوية تحت الأشعة فوق البنفسجية UV أنها بلورة بروتينية، كما شاهدتم في هذا الفيديو. وبمجرد توفر الخلايا B، يمكن خلطها مباشرة مع البروتين المنقى، ومن هذه النقطة فصاعداً، تسير عملية التبلور تماماً كما في البروتوكولات القياسية القائمة على المنظفات.

وتتمثل ميزة أخرى بارزة في القدرة على تطعيم الخلايا البائية (B cells) بليبيدات محددة لأغراض التحسين. وتتميز هذه التقنية بمرونة كبيرة وبساطة في الاستخدام، مما يجعلها خياراً يستحق التجربة في جميع مشاريع بلورة بروتينات الغشاء.