تقييم المحاكمات تبلور ثنائي الأبعاد للبروتينات غشاء الصغيرة للدراسات البيولوجيا الهيكلية التي البلوريات الكترون

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد أكثر ظروف البلورة ثنائية الأبعاد (2D) مثالية للتحديد البنيوي لبروتينات الغشاء عن طريق البلورة الإلكترونية. ويتم تحقيق ذلك أولاً باستخدام منظف متوافق أثناء التنقية لإذابة البروتين من الطبقة الدهنية الثنائية الأصلية. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إضافة دهون خارجية وإزالة المنظف عبر ديالزة مزيج البروتين والدهون والمنظف، مما يؤدي إلى تكوين بلورات ثنائية الأبعاد في ظل ظروف محكومة بدقة.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في التجميد السريع للعينات لتحويلها إلى حالة زجاجية. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي جمع البيانات عن طريق cryo em. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تتيح استنباط البنية النهائية للبروتين من خلال المعالجة الحاسوبية لصور البيانات.

مرحباً، أنا من المختبر. أعمل في كلية البيولوجيا في معهد جورجيا للتكنولوجيا. مرحباً، أنا تينا دريديد.

أنا من مختبر بيري في مدرسة الكيمياء والكيمياء الحيوية ومختبر شميت كراي في مدرسة البيولوجيا بمعهد جورجيا للتكنولوجيا. وأنا مات جونسون من مختبر إنغلبورغ شميدت كراي في مدرسة البيولوجيا بمعهد جورجيا للتكنولوجيا. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتقييم تجارب الارتباط الكيرالي ثنائي الأبعاد (2D chiral correlation trials) بواسطة em.

نستخدم هذا البروتوكول في مختبرنا لتحديد وتحسين ظروف البلورة ثنائية الأبعاد (2D). لذا، دعونا نبدأ؛ لبدء هذا الإجراء، يتم تحضير عينات مصبوغة سلبياً على شبكات مجهر إلكتروني نافذ (TEM) من النحاس بمسامية 400 مغطاة بالكربون. يتم سحب 2 µL من عينة البروتين الليبوزومي ووضعها تحت شبكة TEM المغطاة بالكربون، ثم تُحضن لمدة 60 ثانية.

إذا لم تكن العينة موزعة بشكل متساوٍ، فقم بمسحها برفق باستخدام جانب طرف الماصة. بعد ذلك، قم بسد الحافة بقطعة ممزقة من ورق ترشيح watman رقم 4. يضمن ذلك الإزالة المثالية للسائل دون إزالة مفرطة لـ protea liposomes، ويساعد في الحفاظ على غشاء الكربون الرقيق.

مباشرة بعد عملية التجفيف بالترشيح، يتم وضع 2 µL من صبغة خلات اليورانيا بتركيز 1%، وبعد 30 ثانية، يتم التجفيف بالترشيح من حافة الشبكة. ومجدداً، إذا كانت العينة تحتوي على تركيزات عالية من الجلسرول أو السكروز اللزوج، والتي تتراوح عادة بين 10 إلى 20%، فقد يكون من المفيد إجراء عدة دورات من غسل الشبكة بمحلول منظم خالٍ من الجلسرول أو السكروز قبل عملية الصبغ السلبي للسماح بالصبغ الصحيح باستخدام محلول خلات اليورانيا.

بمجرد تحضير الشبكات، يُستخدم المجهر الإلكتروني لمعاينة العينة بتكبير منخفض لتقييم توزيع وجود الغشاء ومورفولوجيته والجودة العامة للشبكة. بعد ذلك، يُستخدم التكبير العالي للحصول على الصور وإجراء تحويلات RIA للصور لتحديد البلورات ثنائية الأبعاد (2D crystals). لبدء معاينة الشبكة في حامل عينات المجهر الإلكتروني، وللحصول على انطباع أولي عن متوسط توزيع الغشاء، استخدم تكبيراً متوسطاً يتراوح من 2000 إلى 10,000 x.

دوّن مدى توزيع الأغشية ومورفولوجيتها وحجمها في دفتر المختبر. وسجّل مناظر ممثلة باستخدام كاميرا CCD. بعد ذلك، إذا لزم الأمر، افحص العينات بتكبير منخفض في نطاق يتراوح تقريبًا بين 400 إلى 800 x للحصول على نظرة عامة على الشبكات.

يمكن أن يوفر هذا معلومات قيمة لتقييم تحضير الشبكة من خلال الكشف عن المشكلات المتعلقة بتركيز العينة، والتوزيع غير المتساوي للبروتينات أو الليبوزومات، والكسر الجزئي لغشاء الكربون. حدد منطقة اهتمام في الشبكة باستخدام تكبير منخفض أو متوسط، ثم استخدم التكبير العالي لتقييم الترتيب المحتمل في الأغشية المختلفة.

يعد هذا الأمر بالغ الأهمية في المراحل المبكرة من تجارب التبلور ثنائي الأبعاد (2D crystallization). ومن أجل تحديد الليبوزومات البروتينية الواعدة التي تحتوي على مناطق منظمة جيداً، وللتحقق من قابلية التكرار خلال التجارب اللاحقة لتحديد إعداد التكبير العالي الأمثل لفحص البلورات ثنائية الأبعاد، ابدأ بتكبير يتراوح بين 50,000 و 60,000 x. وبناءً على أبعاد البلورة ثنائية الأبعاد وحجم الخلية الوحدة، يمكن خفض إعداد التكبير العالي إلى 30,000 أو رفعه إلى 80,000.

هنا، في موقع مجاور لمنطقة الصورة ذات الاهتمام، نقوم بإلغاء التركيز بمقدار 400 nanometers- تقريبًا أو أكثر إذا كان هناك شك في كون المنطقة ذات الاهتمام هي غشاء بالفعل. افحص العينة بحثًا عن قطع من غشاء الكربون أو MICA أو أي شوائب أخرى يمكن الخلط بينها وبين الـ protea liposomes. لاحظ أيضًا الحواف لتمييز طي الغشاء ومورفولوجيته النموذجية.

بعد ذلك، يتم فحص المنطقة محل الاهتمام باستخدام كاميرا CCD. ومن خلال التقاط صورة CCD عند إعداد التكبير العالي الأمثل، قد لا تكون الشبكة الخاصة ببروتين غشائي أصغر و/أو كاره للماء غالباً قابلة للملاحظة من خلال التقييم البصري لصورة CCD نفسها. وفي هذه الحالة، يتم استخدام الصورة بأكملها لإجراء تحويل فوريه سريع عبر الإنترنت أو ft.

ومع ذلك، إذا كانت المصفوفة المرتبة صغيرة، فسيحتوي تحويل فوريه (FT) هذا على كمية كبيرة من الضوضاء؛ ولتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، قم بتقليل حجم المربع المحيط بالصورة، وحرك المربع المصغر فوق الصورة، ثم قم بإجراء تحويل فوريه حي، واضبط دالة غاما الخاصة بتحويل فوريه الحي للتعرف الأمثل على المصفوفات المرتبة. إذ يمكن لقيمة غاما المرتفعة للغاية أن تحجب البقع بسبب مساهمات الضوضاء، بينما ستمنع القيمة المنخفضة للغاية التعرف على البقع الأضعف. توقع أن تكون دقة البلورات ثنائية الأبعاد المصبوغة سلباً حوالي 15 angstroms عند DFO قدره minus 400 nanometers.

يُتوقع تحديد رتبة واحدة إلى ثلاث رتب من البقع. لاحظ مدى حدة البقع ووجود أي فسيفساء. تبلغ أحجام بلورات ثنائية الأبعاد لبروتين غشائي صغير بحجم 18 kilodalton عدة ميكرونات.

تُظهر البقع الحادة والواضحة في تحرك صندوق تحويل فوريه (FT) الحي على شاشة تحويل فوريه السريع (FTS) أن الشبكة مستمرة وبدون فسيفساء. يمكن تحديد شبكة بروتين أكبر ذو نطاق قابل للذوبان أكثر اتساعاً على الشاشة الصغيرة لمجموعة صور T-E-M-C-C-D، وتعد صور FT ضرورية للحصول على تقييم أفضل لجودة الشبكة، بما في ذلك خصائص مثل ضوضاء الفسيفساء في FT لبروتين غير منظم. قد يتم الخلط بين الليبوزوم والبقع الضعيفة لتحديد ما إذا كانت البقع ناتجة عن بلورات بروتينية ثنائية الأبعاد صغيرة أو مجرد ضوضاء.

حرك الصندوق الخاص بالـ ft الحي. إذا اختفت البقع فوراً فهي عبارة عن ضوضاء، ولكن إذا بقيت دون تغيير حتى عبر مساحة صغيرة، فمن المرجح وجود بلورات لأن بلورات الدهون تظهر مورفولوجيا و ft مميزين. ويمكن التعرف على بلورات الدهون هذه أيضاً من خلال الفحص البصري للصورة وأحجام وحدة الخلية المتسقة.

قد يحدث تـرسيب في التجارب الأولية. ويُستخدم الفحص بالتكبير العالي للتمييز بين ترسيب البروتين وتجمعات الدهون. وفي حالة تجمعات الدهون، قد تكون عملية إعادة التكوين قد حدثت بالفعل، وستتطلب التجارب التالية فقط ضبط المعلمات اللازمة لزيادة حجم الغشاء وتحقيق النظام بدلاً من تحفيز إعادة التكوين عند 30,000 إلى 50,000 x.

تُظهر حواف هذه الهياكل الداكنة أنها تتكون من أغشية خالية من البروتين. وستحتوي عينات الترسيب تحت الظروف المثلى على نسبة كبيرة من البلورات ثنائية الأبعاد. ليس من الضروري السعي لتحقيق مظهر متجانس للأغشية، حيث يتم اختيار أكبر البلورات ثنائية الأبعاد وأكثرها انتظاماً بصرياً لجمع البيانات.

سيتم التعرف على هذه الأنواع من العينات بسهولة عندما يتم استخدام التبلور في مثل هذه العينات لجمع بيانات المجهر الإلكتروني المبرد (cryo EM) بهدف الحصول على أكبر عدد ممكن من الصور عالية الدقة. سنوضح لكم كيفية فحص البلورات ثنائية الأبعاد (2D crystal) لبروتينات الغشاء الصغيرة باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) عند تنفيذ هذا الإجراء. ومن المهم تذكر ضرورة الدقة والشمول لعدم إغفال أي حالة تبلور واعدة، خاصة وأنكم قد استثمرتم بالفعل قدراً كبيراً من الوقت والجهد حتى هذه المرحلة.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.