الكشف عن مباشرة النشاط خلات تشكيل لأنزيم كيناز خلات

تهدف هذه التجربة إلى القياس المباشر لنشاط تكوين الأسيتات لإنزيم أسيتات كيناز. ابدأ التفاعل بإضافة الإنزيم إلى خليط تفاعل يحتوي على أسيتيل فوسفات وركائز DP. بعد ذلك، أضف هيدروكلوريد الهيدروكسيلامين لتحويل أسيتيل الفوسفات المتبقي إلى أسيتيل هيدروكسيلات.

أضف محلول التحميض لتحويل أسيتيل هيدروكسيلات إلى معقد هيدروكسيلات الحديديك الملون الذي يمكن قياسه. تتيح النتائج المستندة إلى القياس الطيفي الضوئي لكمية ركيزة أسيتيل الفوسفات المستهلكة في التفاعل تحديد معاملات حركية الإنزيم. تكمن ميزة هذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أنها تعتمد على القياس المباشر لاستهلاك أسيتيل الفوسفات بدلاً من ربط إنتاج TP باختزال ADP. ونظراً لأن هذا المقايسة لا تعتمد على إنتاج TP، فيمكن استخدامها لمجموعة جديدة من كاينيزات الأسيتات التي تنتج فوسفات غير عضوي بدلاً من TP. ولإعداد منحنى قياسي من ست إلى ثماني نقاط، خفف المحلول المخزون من أسيتيل الفوسفات في 100 millimolar triss وصولاً إلى حجم عينة نهائي قدره 300 µL، مع تضمين عينة ضابطة بدون أسيتيل الفوسفات، ثم قم بموازنة جميع العينات في كتلة تسخين عند 37 °C لمدة دقيقة واحدة.

الآن، أضف 50 µL من هيدروكسيلامين هيدروكلوريد بتركيز 2 M، واخلط عن طريق الرج ثلاث مرات، ثم حضّن العينات في كتلة تسخين عند 60 °C لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، أضف 100 µL من محلول الإظهار واخلط عن طريق الرج ثلاث مرات، واترك اللون يتطور لمدة دقيقة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. قم بطرد العينات مركزياً باستخدام كوفيتات بلاستيكية مخصصة لجهاز المطياف الضوئي.

قِس العينات عند 540 نانومتر. انتقل بعد ذلك لإنشاء منحنى قياسي للامتصاصية عند 540 نانومتر مقابل ميكرومول من أسيتيل الفوسفات باستخدام برمجيات تحليل البيانات والرسم البياني المناسبة. احسب قيمة r squared.

وزع حصصاً حجمها 300 µL من خليط التفاعل في أنابيب طرد مركزي دقيقة. تذكر تضمين تفاعل ضابط بدون إنزيم، ثم قم بموازنة الأنابيب لمدة دقيقة واحدة عند 37 °C. في حال إجراء تفاعلات متعددة، أضف الإنزيم إلى الأنابيب في فواصل زمنية محددة وأعد كل أنبوب فوراً إلى الكتلة الحرارية عند 37 °C.

بعد خمس دقائق، أضف 50 µL من هيدروكسيلامين هيدروكلوريد بتركيز 2 M، ثم اخلط المزيج واحضه لمدة خمس دقائق عند 60 °C. بعد ذلك، أضف 100 µL من محلول الإظهار، واخلطه واتركه في درجة حرارة الغرفة حتى يتطور اللون. ثم قم بطرد العينات مركزياً عند 18,000 ×g لمدة دقيقة واحدة.

باشر بقياس الامتصاصية عند 540 نانومتر. حدد كمية أسيتيل الفوسفات الموجودة من خلال المقارنة بمنحنى أسيتيل الفوسفات القياسي. يمكن تمثيل البيانات بيانياً ومطابقتها مع معادلة McKayla Cementin لتحديد المعاملات الحركية.

يحدد هذا المقايسة استهلاك مادة ركيزة أسيتيل الفوسفات لقياس نشاط إنزيم أسيتات كيناز في اتجاه تكوين الأسيتات. يتم تحويل أسيتيل الفوسفات المتبقي بعد وقت محدد خلال التفاعل الإنزيمي إلى أسيتيل أوكسيبات، ومن ثم إلى معقد هيدروكسي أسيتات الحديديك، والذي يتميز بلون محمر يمكن قياسه عند 540 نانومتر. يمتلك منحنى المعايرة القياسي النموذجي الذي يمثل الامتصاصية عند 540 نانومتر مقابل ميكرومول من أسيتيل الفوسفات ميلاً قدره 1.2332 وحدة امتصاصية لكل ميكرومول من أسيتيل الفوسفات.

تشير قيمة r squared الناتجة والتي بلغت 0.99 إلى أن البيانات تتوافق جيداً مع المعادلة الخطية كما هو موضح هنا. يمكن استخدام هذا المقايسة لتحديد قيمة KM لـ acetyl phosphate لمحضرات إنزيمية مختلفة. عند تركيز 5 millimolar من DP مع تركيزات متفاوتة من acetyl phosphate، يتبع إنزيم acetate kinase المأشوب المنقى من methanol Sarina thermophilic حركية McKayla cementin القياسية لكل ركيزة، مما يؤدي إلى قيمة KM ظاهرة تبلغ 0.27 ± 0.01 millimolar من acetyl phosphate.

على عكس المقايسة المقترنة القياسية، يمكن لهذه المقايسة المباشرة قياس نشاط كينازات الأسيتات التي تستخدم ركائز أخرى غير TP. فعلى سبيل المثال، عند استخدام أسيتيل الفوسفات بواسطة كيناز الأسيتات في *E. histolytica* المنتج للبيروفوسفات، تم استبدال DP بفوسفات الصوديوم في خليط التفاعل. يشير المنحنى الناتج إلى قيمة KM ظاهرة تبلغ 0.50 ± 0.006 millimolar من أسيتيل الفوسفات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك تصور جيد عن كيفية قياس نشاط كيناز الأسيتات بشكل مباشر عن طريق تحديد كمية أسيتيل الفوسفات المستهلكة.

يتمثل العامل الرئيسي في الحصول على نتائج قابلة للتكرار في الحفاظ على الاتساق في كل خطوة، خاصة عند إضافة الإنزيم وفي خطوة الخلط.