كشف وعزل خلايا الميلانوما تعميم استخدام Flowmetry الضوئي

الهدف من التجربة التالية هو الكشف عن وجود السرطان قبل تشكل الأورام الثانوية. ويتحقق ذلك أولاً عن طريق الحصول على عينات دم من مرضى الميلانوما في المرحلة الرابعة وفصلها. وفي الخطوة الثانية، يتم إدخال الدم في غرفة تدفق صوتية ضوئية، مما يسمح بالكشف عن خلايا الميلانوما وعزلها.

بعد ذلك، يتم تصوير الخلايا الملتقطة للتأكيد على وجود الميلانوما المكتشفة. وتظهر النتائج قدرة النظام على كشف وعزل خلايا الميلانوما بدقة وسرعة استناداً إلى أشكال الموجات الصوتية الضوئية وتقنيات تصوير الخلايا. وتتمثل الميزة الرئيسية لتقنيتنا مقارنة بالطرق الحالية التي تكشف عن خلايا الميلانوما الجائلة، مثل R-T-P-C-R، والفرز المغناطيسي للخلايا الحيوي، وغيرها من الطرق، في أن طريقتنا خالية من الوسوم، وهي تسمح بالتقاط خلايا الميلانوما الجائلة دون تغيير سطحها أو تثبيتها على ركيزة.

لتحضير عينة للكشف عن السرطان النقيلي، ابدأ بسحب 10 milliliters تقريبًا من الدم الكامل من مريض سرطان في المرحلة الرابعة. في أنبوبي vacutainer سعة خمسة milliliter، قم بطرد الأنابيب مركزياً لمدة 10 دقائق. عند 3000 RPM، ستنفصل عينة الدم إلى ثلاث طبقات مختلفة، حيث تتكون الطبقة السفلية من كريات الدم الحمراء.

تحتوي الطبقة الوسطى، والتي تسمى أيضاً الطبقة الكريمية (buffy coat)، على الكريات البيضاء وخلايا الميلانوما، بينما تحتوي الطبقة العلوية على البلازما والصفائح الدموية. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من البلازما دون المساس بالطبقة الكريمية. أضف 250 µL من his opaque 10 77 إلى أنابيب troop سعة 2 mL.

باستخدام ماصة باستير بطول تسع بوصات، استخلص ما تبقى من البلازما، وطبقة غطاء البافى (Buffy coat) بأكملها، والطبقة العلوية من كريات الدم الحمراء. مع التأكد من جمع كمية أقل من 500 µL. انقل المحلول إلى أنابيب Wind Trobe التي تم تحضيرها مسبقاً.

سوف ينفصل الدم مرة أخرى، ولكن هذه المرة ستنفصل الكريات الحمراء بواسطة الـ hispa، مما يسمح باستخلاص الطبقة البيضاء (Buffy coat) بسهولة. استخدم ماصة Pesa مقاس تسع بوصات لعزل الطبقة البيضاء بالكامل ووضعها في أنبوب eend orph سعة 2 milliliter. ثم قم بتعليقها في 1.5 milliliter من PBS مع 2% volume per volume بين 20.

لإنشاء غرفة تدفق، ابدأ باسطوانة أكريليك بطول 8 mm وبقطر خارجي 20 mm وقطر داخلي 17 mm. بعد ذلك، احفر ثلاث فتحات بقطر 5 mm في جانب الاسطوانة بزوايا 90 درجة من بعضها البعض. ثم اقطع ثلاث قطع من أنابيب البوليمر وضعها في الفتحات المحفورة.

قم بمد غشاء البارافيلم (para film) عبر الجزء السفلي من الحلقة الأكريليكية لإنشاء سدادة مانعة لتسرب الماء. سيشكل غشاء البارافيلم وعاءً ضحلاً مع الحلقة الأكريليكية، وسيحوي محلول الأكريلاميد الذي سيشكل غرفة التدفق. قم بتعليق سلك بقطر 1.6 millimeter عبر قطع الأنابيب المتقابلة مباشرة، مع التأكد من أن السلك وحده هو الظاهر من خلال منتصف الحلقة وصولاً إلى قطعة الأنبوب الثالثة.

أدخل سلكاً بقطر 1.6 millimeter وضع الأنبوب على مسافة millimeter واحد من السلك المعلق. تمنع هذه الأسلاك دخول acrylamide إلى الأنابيب. قم بتحضير 5 milliliters من acrylamide.

بعد ذلك، صب الخليط بسرعة في الحلقة الأكريليكية، مع ملئها حتى الأعلى. بعد بضع ثوانٍ، سيتحول المحلول إلى هلام. ولصنع قالب غرفة التدفق، اسحب الأسلاك للخارج بعناية مع الحرص على عدم تعكير هلام الأكريلاميد، مما يترك مسار تدفق أسطوانيًا ومكانًا لوضع ليف بصري مركز على مسار التدفق.

غرفة التدفق الآن جاهزة للاستخدام صوتياً باستخدام هلام الموجات فوق الصوتية. قم بتوصيل محول طاقة صوتي كهرضغطي من فلوريد بولي فينيليدين بغرفة التدفق مباشرة فوق مسار التدفق. وباستخدام موصل بايونيت أو كابل BNC، قم بتوصيل محول الطاقة بمدخل مستقبل واسع النطاق.

قم بتوصيل مخرج المرشح براسم الإشارات لتفعيل عملية القدح في راسم الإشارات. ثبّت صماماً ثنائياً ضوئياً بالقرب من المحول، واستخدم كابل B NNC لتوصيله براسم الإشارات. اسحب الأنبوب الصغير الخاص بغرفة التدفق حتى تتكون جيب هوائية صغيرة، ثم قم بربطه بالمحول.

بعد ذلك، أدخل الليف البصري واملأ الجيب بالماء لتقليل إشارات الواجهة وزيادة كمية ضوء الليزر المسلط على مسار التدفق. وبسبب الفتحة العددية لليف البصري والمسافة القصيرة إلى مسار التدفق، سيقوم الليزر بإشعاع سدادة واحدة فقط من العينة في أي وقت محدد، مما يضمن أن العينة الموجودة مباشرة أمام الليزر هي نفسها العينة التي تولد الإشارات الصوتية الضوئية.

بعد ذلك، قم بتوصيل وصلة على شكل T بأحد أذرع غرفة التدفق، وقم بتوصيل مضختي حقنة بالفرعين الآخرين للوصلة. تحتوي إحدى الحقنتين على الهواء بينما تحتوي الأخرى على معلق الخلايا الذي تم تحضيره مسبقاً. ثم ابدأ بتشغيل مضختي الحقنة معاً.

عندما يصل السائلان المقبولان إلى الوصلة التي على شكل حرف T، سيتم تقسيمهما إلى سدادات متجانسة تتدفق عبر المحول. قم بتسليط نبضة ليزر نانوية على العينة المتدفقة لتوليد موجات صوتية ضوئية في خلايا الميلانوما. وبما أن الميلانين ممتص بصري واسع النطاق، فيمكن استخدام أي طول موجي مرئي لليزر.

تشير الإشارة التي تظهر على جهاز رسم الإشارات (oscilloscope) عندما تكون السدادة فوق المحول إلى أن السدادة تحتوي على ميلانوما. تتبعها عبر النظام قبل إسقاطها في وعاء تجميع. ولتحضير العينات للكيمياء النسيجية الخلوية المناعية، ضع شرائح زجاجية في أقماع الطرد المركزي الخلوي (cyto funnels) ثم حملها في جهاز الطرد المركزي الخلوي (cyto spin) للمساعدة في تثبيت الخلايا المجمعة على الشرائح الزجاجية.

ضع 100 µL من 1%BSA في PBS في كل قمع. ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 600 RPM لمدة ثلاث دقائق. بعد الطرد المركزي، أضف عينات الخلايا إلى أقماع CyTOF، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 600 RPM لمدة ثلاث دقائق.

رش الشرائح بمثبت يعتمد على الإيثانول. بعد ذلك، اغسل الشرائح في PBS لمدة 10 دقائق مرتين لمنع الارتباط غير النوعي. حضن كل شريحة مع خليط مكون من 10 µL من مصل الماعز و 90 µL من PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد فترة التحضين، قم بتفريغ الشرائح وإضافة محلول الأجسام المضادة الأولية. يجب أن تحتوي كل شريحة على 1%rabbit mark، وواحد 1%mouse CD 45، و10%goat serum في PBS، ثم تُحضن لمدة ساعة واحدة في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، تُغسل الشرائح في PBS لمدة 10 دقائق ثلاث مرات.

بعد ذلك، تُحضن الشرائح في الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المناسبة في الظلام لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم يتم تفريغ السوائل من الشرائح. بعد ذلك تُغسل في PBS لمدة خمس دقائق، ثلاث مرات لصبغ النوى، ثم تُحضن الخلايا مع 0.1 micrograms per milliliter من DPI لمدة دقيقة واحدة. ثم تُفرغ الشرائح وتُغسل في PBS.

أخيرًا، وباستخدام وسط تثبيت قائم على الراتنج، قم بتثبيت غطاء شريحة فوق عينة الخلايا، ثم أحكم إغلاق غطاء الشريحة بطلاء أظافر شفاف وقم بالتصوير باستخدام مجهر فلوري. تظهر هنا على اليسار أشكال الموجات الصوتية الضوئية للخلايا الدموية البيضاء وخلايا الميلانوما. وبما أن الخلايا الدموية البيضاء لا تمتلك تصبغًا ذاتيًا، فإنها لا تنتج موجات صوتية ضوئية وتظهر على شكل خط مسطح من الضوضاء الإلكترونية على اليمين.

ومع ذلك، فإن خلايا الميلانوما المصبغة تنتج موجة صوتية ضوئية قوية. بعد الصبغ المناعي الخلوي والصبغ الكيميائي، تظهر خلايا الميلانوما المستنبتة إشارات مرقطة باللون الأزرق، حيث تم تمييز إحدى الخلايا المحددة باللون الأخضر في الصور المتراكبة لـ DPI وخلية أخرى بـ CD 45 كمؤشر على الكريات البيضاء. يوضح هذا الشكل خلايا الميلانوما بين العديد من خلايا الدم البيضاء بعد تطورها.

سيمهد أسلوبنا الطريق للباحثين في مجال الكشف عن السرطان لاستكشاف ظاهرة الانتقال من أجل تحسين الكشف عن السرطان وفي نهاية المطاف علاج انتشاره القاتل.