تحديد الشركاء البروتين عن طريق التفاعل جنبا الى جنب الانجذاب تنقية

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام طريقة تُعرف باسم التنقية التقاربية الترادفية (Tandem affinity purification) لعزل البروتينات الشريكة المرتبطة بالبروتين. مرحباً، أنا dLAN Bailey من قسم علم الفيروسات في كلية إمبريال لندن. نحن نعمل في مختبرنا على دراسة التفاعلات بين الفيروس والعائل لأعضاء مختلفين من العائلة الفيروسية.

يُعد تحديد البروتينات التي تتفاعل مع بروتينات خلوية أو فيروسية أخرى نقطة بداية رائعة لاستقصاء التفاعل المتبادل بين الفيروس ومضيفه أثناء العدوى. في هذا الفيديو، سأشرح أحد النهج التي نستخدمها في مختبرنا، وهو التنقية الترادفية والتعزيزية أو وسم TAP. وسم TAP المستخدم في هذه الدراسة هو وسم في الطرف N يتكون من وحدتين من البروتين G وببتيد رابط لـ strep adin.

يتم الفصل بين هذه المكونات بواسطة تسلسل قطع لإنزيم TEV protease والذي يسمح بالشطف النوعي للبروتين الطعم. في هذا المثال، يقع بروتين EIF4E الفأري عند الطرف الكربوكسيلي (C terminus) لهذا البناء الاندماجي. يتكون بروتوكول وسم TAP من إجراء مكون من ست خطوات.

بعد عملية عفن الخلايا وإنشاء الخطوط الخلوية، يتم تحفيز الخلايا للتعبير عن بروتين الوسم abate قبل وضعها في محلول تحلل خفيف. تُستخدم خطوتان من التنقية التقاربية ومحلولان متخصصان لتنقية الطعم وأي شركاء تفاعل محتملين لإنشاء الخطوط الخلوية. يجب عفن خلايا HEC 2 93 باستخدام ناقل التعبير P met four المشفر.

يتم بعد ذلك اختيار خلايا بروتين الطُعم المسمى بـ tap باستخدام 100 µg/ml من الهيجروميسين B. وبما أن البلازميد يتم الحفاظ عليه كإبيسوم (episome)، فلا داعي لعزل مستنسخات محددة. يتم تحفيز 10 دوارق من الخلايا الملتصقة عن طريق المعالجة بـ 10 µM من كلوريد الكادميوم لمدة 16 ساعة قبل كشطها في الوسط الغذائي. ثم تُنقل الخلايا المعلقة إلى أنابيب 15 mL ويتم تجميع الخلايا في شكل كريات عن طريق الطرد المركزي.

تُغسل هذه الخلايا بعد ذلك ثلاث مرات بمحلول PBS بارد جداً قبل تجميعها في النهاية على شكل كرة (pellet). في الخطوة الثانية من تحلل الخلايا، يتم تحلل الخلايا في 5 mL من منظم التحلل (lysis buffer) البارد عن طريق السحب المتكرر بالماصة، ثم تُترك على الثلج لمدة خمس دقائق. ولضمان التحلل الفعال، يتم دفع الخلايا عبر إبرة غير حادة ذات قياس ضيق باستخدام سرنجة، ثم تُعرض لدورة تجميد وإذابة.

تُوزع العينة الناتجة في أنابيب سعة 1.5 mil، ثم تُزال الخلايا غير المتحللة والبقايا عن طريق الطرد المركزي. وتجدر الإشارة إلى أن حجم الراسب يتقلص بشكل ملحوظ بعد خطوة الطرد المركزي هذه. بعد ذلك، تُجمع السوائل الطافية من المستخلصات في أنبوب Falcon سعة 15 mil، وتُمَرر عبر مرشح بمسامية 0.45 micrometer لإزالة أي بقايا إضافية.

يجب أخذ أجزاء بمقدار 50 µL من هذه المادة المستخلصة لإجراء التحليلات اللاحقة. ويُشار إلى هذه العينة باسم العينة الأولى. الخطوة الثالثة، الارتباط بـ rabbit IgG Aeros.

في هذه المرحلة من البروتوكول، يتم ترسيب وسوم البروتين G مناعياً باستخدام خرزات rabbit IgG. ولتخصيص خرزات aros، قم بإزالة طرف رأس الماصة؛ حيث يساعد ذلك في تجنب إتلاف الخرزات.

أعد تعليق محلول rabbit IgG aro برفق عن طريق تدوير الزجاجة قبل نقل الـ aros إلى أنبوب سعة 15 mil. اغسل الـ aros ثلاث مرات في محلول lysis buffer مبرد باستخدام الطرد المركزي منخفض السرعة لتنقية الخرزات في كل خطوة. يجب أن تكون خرزات rabbit IgG المترسبة مرئية بعد عملية الطرد المركزي.

بعد كل خطوة، قم بإزالة المحلول المنظم بعناية دون تحريك الحبيبات. وبعد اكتمال الغسلة الأخيرة، أضف المستخلص الخلوي المصفى والمصفى إلى الحبيبات المرصوفة واتركه للحضن لمدة ثلاث ساعات أو طوال الليل. ويُفضل أن يكون ذلك عند درجة حرارة 4 °C باستخدام خلاط دوار.

بعد عملية الترسيب المناعي، قم بطرد خرزات agros مركزياً، ثم أزل الطافي لإجراء التحليلات اللاحقة. إذا لزم الأمر، يمكنك استخدام رأس ماصة دقيق لإزالة أي سائل متبقٍ من هذا الأنبوب. هذا الطافي هو العينة الثانية للخطوة الرابعة من عملية القطع ببروتياز TEV.

في هذه الخطوة، يتم فصل الطعم عن علامات البروتين G. تتيح هذه الخطوة الفصل النوعي لبروتين الطعم، وهو ما يمثل فعلياً خطوة شطف من الترسيب المناعي لـ IgG الخاص بالأرانب. قم بتحضير مزيج قطع TEV وأضفه إلى حبيبات aros باستخدام طرف ماصة تمت إزالة نهايته، ثم انقل هذا المزيج إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مُسيليكون، واقلبه لتعليق حبيبات aros قبل التحضين طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C، ثم اسحب عينة من تفاعل قطع TEV هذا لإجراء التحليل.

هذه هي العينة الثالثة. يجب أن تتيح الحضنة ليلة كاملة على الخلاط الدوار استكمال تفاعل TEV إلى حد كبير. الخطوة الخامسة، الربط لتثبيت حبيبات strept adin.

في هذه الخطوة، يتم تنقية طعم Cleve وأي شركاء ارتباط محتملين باستخدام التنقية التقاربية من المحلول. أولاً، قم بطرد مركزي لتفاعل قطع TEV الذي يحتوي على خرزات rabbit IgG aros. ولترسيب الـ aros، اسحب كمية OTT من supernatant المصفى من أجل التحليل.

هذه هي العينة الرابعة. قم بإزالة كل ما تبقى من السائل الطافي بعناية، والذي يحتوي على بروتين الطعم الخاص بك، وانقله إلى أنبوب جديد. استخدم مجدداً رؤوس ماصة دقيقة.

استخدم رؤوس ماصات معدلة لإزالة كل المادة الطافية الممكنة. احتفظ بخرزات rabbit IgG aros من أجل التحليلات اللاحقة. هذه هي العينة الخامسة.

لمنع تلف حبيبات strep adin، قم بإزالة الطرف من طرف ماصة pet. أعد تعليق الحبيبات برفق وانقل كمية أليكو إلى أنبوب مُسيليكون. اغسل الحبيبات التي تحتوي على strep باستخدام S buffer، مع الترويق عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة.

بعد كل عملية غسل. بعد كل عملية غسل، قم بإزالة المحلول المنظم بعناية. تكون حبيبات Strept adin صغيرة جداً ويمكن إزاحتها بسهولة حتى عند استخدام ماصة دقيقة.

قم ببناء نصائح الحيوانات الأليفة. بعد غسل حبيبات strept adin، أضف الرائق الناتج عن تفاعل قطع TEV إلى هذه الحبيبات، ثم حضن التفاعل لمدة ثلاث ساعات أو طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C، باستخدام خلاط دوار.

بعد التحضين، يتم استخدام جهاز الطرد المركزي لترسيب حبيبات streptavidin وإزالة السائل الطافي. هذه هي العينة السادسة. ملاحظة.

يرتبط بروتين الطعم الآن بالخرز المتبقي في الأنبوب. اغسل خرز الستربتافيدين الذي يحتوي على بروتين الطعم باستخدام محلول التحلل (lysis buffer). ولإزالة أي بروتينات ملوثة إضافية، قم بإزالة محلول الغسيل المتبقي من الخرز واتركها في الثلج.

الخطوة السادسة، شطف البيوتين. في هذه الخطوة، يُضاف البيوتين إلى حبيبات الستريبتأفيدين. يؤدي التفاعل بين البيوتين وحبيبات الستريبتأفيدين إلى إزاحة الطعم، الذي يعود مرة أخرى إلى المحلول.

أضف محلول البيوتين مباشرة إلى الخرزات واقلب الأنبوب للمزج. حضّن التفاعل عند درجة حرارة 4 °C لمدة ثلاث ساعات أو طوال الليل باستخدام جهاز طرد مركزي دوار، ثم اخلط مزيج البيوتين واجمع المزيج بعناية في أنبوب جديد. هذا هو EIT النهائي المشار إليه بالعينة رقم سبعة.

تعتبر خرزات strept havein المتبقية هي العينة الثامنة. وبسبب انخفاض تركيز البروتين فيها، يجب تركيز هذا الناتِج النهائي قبل التحليل. يتم تحقيق ذلك باستخدام أعمدة طرد مركزي ذات حد قطع منخفض للوزن الجزيئي، حيث يتم تقليل الحجم عن طريق الطرد المركزي مع مراقبة العملية بانتظام.

يمكن تقسيم هذه العينة المركزة وتحليلها باستخدام هلام SDS-PAGE عن طريق صبغتي الكوماسي والفضة. وفي حال تحليل العينات بواسطة مطياف الكتلة، ننصح باستخدام الهلامات التجارية مسبقة الصب. بعد ذلك، يمكن استخلاص النطاقات الفردية وتحديد البروتينات بواسطة مطياف الكتلة.

في هذه الحالة، كان الطعم من أصل فأري، وهو EIF لبروتين E. وتكمن ميزة نظام tap في قدرتك على التعبير عن البروتين المُراد دراسته في خط خلوي معين، وبناءً على الخط الخلوي الذي تهتم به، يمنحك هذا النظام أيضاً القدرة على التعبير عن البروتين بمستويات منخفضة نسبياً، وذلك حسبما تقرره، مع الحفاظ على جميع تعديلات ما بعد الترجمة والتوطين، مما يتيح لك غالباً تنقية المعقد الأصلي.