تحديد وتوصيف ارتباط بالغليكوزيل باستخدام بروتين معين إندو وexoglycosidases

الهدف العام من التجربة التالية هو توضيح استخدام glycosate لإزالة السكريات إنزيمياً وتحليل الارتباط السكري من النوع n و O على بروتين سكري نموذجي. ويتم تحقيق ذلك عن طريق معالجة البروتين السكري باستخدام PGA's F أو باستخدام مزيج إزالة السكريات البروتينية. كما تم تدعيم مزيج إزالة السكريات البروتينية بخليط من exo glyco ass إضافية، والتي تساعد أحياناً في إزالة السكريات المقاومة.

نوضح هذه الطريقة باستخدام البروتين السكري النموذجي هرمون الموجّهة الغدية المشيمية البشرية المؤتلف بيتا، أو HCG beta، متبوعاً بتقنية SDS page، ثم التلوين بصبغة Kumasi blue وطريقة تلوين متخصصة للسكريات. استُخدم Pro Q Emerald 300 لتحليل الارتباط الغليكوزيلي. تم الحصول على نتائج عينة HCG beta، والتي أظهرت أن HCG beta يتمتع بزيادة غليكوزيلية غير متجانسة ويحتوي على أشكال غليكانية متعددة بناءً على الاختلافات في هجرة البروتين مع وبدون المعالجة بـ glycosate، وتضاؤل الإشارة عند التلوين بـ ProQ مع إزالة الغليكانات تباعاً.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تحليل مطيافية الكتلة، في بساطتها، واعتمادها على معدات مختبرية شائعة، وملاءمتها لعلماء بيولوجيا السكريات المبتدئين. ويمكن لهذه الطريقة الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال بيولوجيا السكريات، مثل ما إذا كان البروتين الخاص بي مرتبطاً بالسكريات. لبدء عملية إزالة السكريات إنزيمياً، قم بإذابة المحاليل المنظمة المرفقة من طقم إزالة السكريات البروتينية.

امزج الأنابيب جيداً واحفظها في درجة حرارة الغرفة. ضع القوارير التي تحتوي على الإنزيم على الثلج، وأذِب محتويات قارورة HCG beta في 600 microliters من الماء المقطر واحفظها على الثلج. بعد تحضير one milliliter من one XG seven buffer عن طريق تخفيف المخزون 10 x في الماء المقطر، استخدم 25 microliters لتخفيف 0.5 microliters من PGA's f.

قم بتحضير خليط exo glycosate عن طريق دمج مقدار 2 µL من كل من إنزيمات exo glyco الأربعة. بعد ذلك، أضف HCG beta ومحلول glycoprotein denaturing buffer بتركيز 10x إلى سبعة أنابيب PCR مرقمة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب، ثم أغلق الأنابيب وامزجها برفق. قم بمسخ البروتينات في جهاز التدوير الحراري (thermocycler) عن طريق التحضين لمدة 10 دقائق عند 94 °C، يليه تثبيت عند 4 °C. بعد إخراج الأنابيب من جهاز التدوير الحراري، استخدم جهاز الطرد المركزي لإزالة أي تكثف مرئي. أضف الكواشف المتبقية إلى كل أنبوب تفاعل وفقاً للبروتوكول المكتوب. أغلق أنابيب PCR باستخدام أغطية جديدة.

بعد ذلك، اخلط الأنابيب عن طريق النقر عليها برفق أربع مرات بعد تدوير المحتويات لترسيبها، ثم ضع الأنابيب في جهاز التدوير الحراري واحضنها عند 37 °C لمدة أربع ساعات. يتبع ذلك تبريد العينات إلى 4 °C. ولإعداد SDS page، قم بتحضير منظم تحميل SDS مختزل بتركيز 3x طازج.

بإضافة DTT، أضف 12.5 µL من منظم تحميل SDS المختزل المُحضّر بتركيز 3x إلى كل عينة، ثم أغلق الأنابيب بأغطية جديدة وانقر عليها برفق للمزج. قم بحضن الأنابيب في جهاز التدوير الحراري عند 94 °C لمدة خمس دقائق، ثم بردها إلى 4 °C. بعد الحضن، قم بتحميل 30 µL من كل عينة و10 µL من علامة البروتين (protein marker) على هلام tri glycine بتركيز 10 إلى 20%. احفظ المتبقي من كل عينة.

قم بإجراء الرحلان الكهربائي للهلام عند 130 فولت حتى تقترب جبهة صبغة D من أسفل الهلام. وعندما ينتهي تشغيل الهلام، أخرجه من القالب وضعه في صندوق بلاستيكي صغير يحتوي على كمية كافية من صبغة kumasi blue لتغطية الهلام. اترك الهلام لمدة ساعة واحدة مع الرج اللطيف بعد تلوينه.

اغسل ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة. وفي 50 milliliters من محلول detain، سجل الصور باستخدام جهاز transluminator للضوء الأبيض أو ماسح ضوئي. وبدلاً من ذلك، يمكن تجفيف الهلام بين رقائق من السيلوفان.

في إطار العمل، قم بتشغيل المتبقي من كل عينة وعلامة بروتينية على هلام Tri glycine بنسبة 10 إلى 20% أثناء تشغيل الهلام. قم بإذابة كاشف ProQ emerald باستخدام DMF وتحضير المحاليل المخزنة للتثبيت والغسل والأكسدة الخاصة بالصبغة وفقاً لدليل المنتج المرفق مع الطقم. عند اكتمال عملية الرحلان الكهربائي، أخرج الهلام من القالب وضعه في صندوق بلاستيكي.

قم بتثبيت الهلام بإضافة 100 milliliters من محلول التثبيت المُحضّر. اترک الهلام طوال الليل في درجة حرارة الغرفة مع التقليب اللطيف في اليوم التالي. اغسل الهلام باستخدام 100 milliliters من محلول الغسيل المُحضّر لمدة تتراوح من 10 إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع التقليب اللطيف، وكرر عملية الغسل مرة ثانية باستخدام محلول غسيل جديد.

بعد ذلك، قم بأكسدة الكربوهيدرات عن طريق تحضين الهلام مع رج خفيف لمدة 30 دقيقة في 25 milliliters من محلول الأكسدة المُحضّر، ثم اتبع عملية التحضين بغسلتين إضافيتين أثناء غسل الهلام. قم بتحضير صبغة ProQ emerald 300 جديدة عن طريق إضافة 500 microliters من محلول كاشف ProQ Emerald 300 إلى 25 milliliters من محلول التخزين الخاص بالصبغ المرفق في الطقم. قم بصبغ الهلام عن طريق التحضين في الصبغة المُحضّرة في ظروف مظلمة مع رج خفيف لمدة تتراوح من 90 إلى 120 دقيقة بعد صبغ الهلام.

كرر خطوتي الغسل كما هو موضح سابقاً. ثم قم بتسجيل الصور باستخدام جهاز إضاءة خلفية بالأشعة فوق البنفسجية (UV trans illuminator) عند طول موجي 300 nanometers. وفي الخطوة النهائية، قارن صور الهلام المصبوغ بصبغة kumasi مع صور الهلام المصبوغ بصبغة ProQ emerald.

يمكن ملاحظة التغيرات في هجرة البروتين بعد إزالة السكريات إنزيميًا عند مقارنة عينة الضبط مع المعاملة F لـ PGA. ولإزالة n-glycans، يتم استخدام مزيج Deglycosylation mix لإزالة n-glycans و O-glycans، حيث لا يُلاحظ أي نقص إضافي في الحجم بعد الهضم باستخدام glycosate إضافي. وبالإضافة إلى التغير في الكتلة، تصبح الحزم أكثر حدة مع إزالة السكريات.

من المرجح أن الحزمة التي تظهر أسفل علامة 17 kilodalton تمثل ببتيد HCG beta منزوع الغليكوزيل بالكامل. وتظهر الحزم المقابلة لـ Glyco في المسارات من خمسة إلى سبعة. وقد تكون الحزم الأخرى ناتجة عن عملية إزالة الغليكوزيل غير المكتملة أو عن بروتينات متعددة غير محددة موجودة في عينة HCG beta.

يعمل كاشف الأخضر الزمردي على أكسدة وصبغ جميع الغليكانات الموجودة في جزيء البروتين. وبناءً على ذلك، تنخفض شدة الإشارة مع إزالة السكريات إنزيميًا من HCG beta. وتشير الإشارة المتبقية في المسارين الثالث والرابع إلى وجود أنماط غليكانية مقاومة للإنزيمات المستخدمة.

تُستخدم كمية إضافية من الجليكوزات في المسار الرابع. قم بإزالة بضع بقايا سكر إضافية. يظل ترحيل البروتين كما هو، ولكن يمكن ملاحظة انخفاض طفيف في كثافة الصبغ.

لم تكن أجزاء السكر المقاومة موجودة في جميع أنواع البروتينات. ولم يتم الكشف عن بعض النطاقات بواسطة صبغة emerald Green، مما يشير إلى أنها خضعت لعملية إزالة جليكوزيلة واسعة النطاق. وتدعم البيانات الإضافية الاستنتاج بأن HCG beta يتم جليكوزيلته بشكل غير متجانس. ويظهر النطاق السفلي في المسار الثاني باهتًا في صورة emerald green.

بينما تظهر الحزمة العلوية في المسار الثاني ساطعة، مما يشير إلى أن العديد من مجموعات GLYCAN لا تزال موجودة، فإن هذه البيانات تدعم الاستنتاج بأن HCG beta المؤتلف الذي تم التعبير عنه في خلايا الفأر يحتوي على أشكال جليكوزيل متعددة بسبب التغاير المتأصل في عملية الجليكوزيل. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل مطيافية الكتلة للإجابة على أسئلة إضافية مثل: ما هو معدل الإشغال؟ وما هو مدى الجليكوزيل، أو ما هو التركيب الدقيق للجليكانات؟

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام glycosylate لإزالة السكريات إنزيميًا وتحليل الغليكانات المرتبطة بـ NNO على البروتينات السكرية. قد يكون اختيار طريقة الكشف أمرًا صعبًا لأن مناطق صبغ البروتين تكون مفيدة فقط إذا أدت عملية إزالة السكريات إلى إزاحة ملحوظة في الكتلة الجزيئية للبروتينات الأخرى.

لقد لاحظنا حدوث هجرات غير طبيعية بعد عملية إزالة السكر، ووجدنا أن أي تغيير في الهجرة يعد دليلاً على أن البروتين قد خضع لعملية إزالة السكر.