تقييم الخلية الجذعية السرطانية الهجرة عن طريق أجهزة ميكروفلويديك Compartmentalizing والتصوير لايف الخليوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو الفحص البصري وتوصيف هجرة الخلايا السرطانية عبر جهاز مائعي مجهري مقسم. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تفكيك الكرات العصبية الموجودة مسبقاً من الخلايا الجذعية للأورام الدماغية التي نمت في وسط خالٍ من المصل. وتتمثل الخطوة الثانية في تصنيع قالب رئيسي من SU 8 ثنائي الطبقة، واستخدام تقنية الليثوغرافيا اللينة لإنتاج ختم PDMS يتميز بتصميم مقسم.

بعد ذلك، قم بتجميع الجهاز الموائع الدقيقة وتحميله بالخلايا الجذعية للأورام الدماغية. وأخيرًا، يتم إجراء تصوير زمني طويل المدى لهجرة الخلايا الجذعية للأورام الدماغية باستخدام نظام مجهري متكامل. وفي النهاية، تظهر النتائج أن الخلايا الجذعية للأورام الدماغية تظهر تسلسلاً دوريًا من المراحل المورفولوجية أثناء هجرتها عبر مساحة فائقة الضيق.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالأنظمة الموجودة مثل غرفة Transwell Boyton، في أن الجهاز الدقيق يتيح الفحص البصري لعملية الهجرة، والوضع الموجه للخلايا، والتوصيل الدقيق للعوامل. وبناءً على ذلك، تتميز تكنولوجيا الموائع الدقيقة بكونها موثوقة وفعالة ومنخفضة التكلفة في اختيار الخلايا المفردة وتوجيهها. وتمتد تطبيقات هذه التقنية إلى علاج نقائل السرطان وعودته، حيث إن تحليل الخلايا المفردة ذات القدرة العالية على الهجرة قد يساهم في تحديد أهداف مستقبلية محتملة للعلاج الكيميائي.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول سلوك الهجرة في أنظمة السرطان، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل التطور الجنيني، والاستجابات المناعية، والتئام الجروح، وتجدد الأعضاء. وبالبدء بمعلق خلوي من الأجسام العصبية المشتقة من BTSC، يتم تجميع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter ثم يتم طردها مركزياً بسرعة 900 RPM لمدة خمس دقائق، مع الحرص على عدم تجاوز هذه السرعة.

قم بشفط السائل الطافي. ثم اسمح للكرات العصبية بالتفكك عن طريق تحضينها في 0.5 milliliters من Accutane المُدفأ مسبقاً لمدة تتراوح من خمس إلى 10 دقائق عند 37 °C. بعد التحضين، قم بتفكيك الخلايا ميكانيكياً عن طريق سحب السائل بلطف من 10 إلى 20 مرة باستخدام ماصة P 100.

بعد ذلك، أضف 1.5 milliliters من وسط الخلايا الجذعية لمعادلة Accutane، ثم قم بطرد تعليق الخلايا مركزياً بسرعة 1300 RPM لمدة خمس دقائق، وأعد تعليق الخلايا في 1 milliliter من وسط الخلايا الجذعية. تحقق من كثافة الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer) واضبط الكثافة لتصبح 20,000 خلية لكل microliter. لبدء تصنيع القالب الرئيسي SU eight، قم بإعداد قناعين ضوئيين باستخدام برنامج Adobe Illustrator وفيلم شفاف للطباعة بالليزر باستخدام جهاز Image Setter.

تتكون قناع التصوير الضوئي للطبقة الأولى من علامتين مرجعيتين ومصفوفة من القنوات الدقيقة، بينما يحتوي قناع التصوير الضوئي للطبقة الثانية على غرف التثبيت والاستقبال. نظف كلا طبقتي القناع باستخدام الإيزوبروبانول واتركهما ليجفا في الهواء. الآن، قم بطلاء رقاقة حاملة بطريقة التدوير بطبقة من مقاوم الضوء SU eight بسمك 3 micron، يليه الخبز اللطيف.

بعد ذلك، قم بتعريض المقاومة الضوئية للأشعة فوق البنفسجية (uv) مع وضع قناع الصورة للطبقة الأولى في تلامس وثيق، واتركها حتى تتصلب. ثم قم بعملية الخبز اللاحق وتحميض الرقاقة المصلبة. قم بتغطية مناطق علامات المرجعية (fiducial marker) في رقاقة المناولة باستخدام شريط لاصق.

بعد ذلك، قم بطلاء الرقاقة بطريقة الطلاء الدوراني بطبقة من مادة مقاومة الضوء بسُمك 250 micron. بعد ذلك، قم بإزالة الشريط لإظهار علامات التحديد لأغراض المحاذاة. ضع الطبقة الثانية من مادة مقاومة الضوء وقم بمحاذاة علامات التحديد المرجعية.

بعد ذلك، يتم تعريض القناع الضوئي للطبقة الثانية للأشعة فوق البنفسجية ومعالجته، يليه الخبز اللاحق والتحميض. الآن يتم معالجة قالب SU-8 عبر الترسيب البخاري لتقليل لزوجة السطح. توضع الرقاقات في مجفف مع عدة قطرات من محلول Tri Chloro cline تحت التفريغ لمدة ساعة واحدة على الأقل.

سيكون القالب الرئيسي حينئذٍ جاهزاً للاستخدام لصب الـ PDMS باستخدامه. ابدأ بخلط قاعدة البوليمر الأولي مع العامل المصلب جيداً بنسبة 10 إلى 1. ثم ضع الخليط في مجفف لإزالة الغازات تحت تفريغ هوائي حتى تختفي جميع فقاعات الهواء.

صب الخليط على القناع وقم بإزالة الفقاعات الهوائية مرة أخرى. في حال ظهور فقاعات هوائية جديدة، قم بمعالجة القالب على لوح تسخين مستوٍ لمدة ساعتين عند 90 °C. وبعد أن يبرد إلى درجة حرارة الغرفة، قم بتحرير ختم PDMS برفق.

وبذلك يتم حفر قنوات الزرع في PDMS وتصبح جاهزة لتجميع الجهاز الموائع الدقيق. يمكن إعادة استخدام القالب الرئيسي في عملية القولبة حتى يتشقق أو يتآكل. وعندما يصبح القالب الرئيسي لزجاً، يمكن إعادة تطبيق طبقة طلاء مانعة للالتصاق.

ابدأ بعمل فتحات للمداخل والمخارج في الجهاز الموائع الدقيقة من خلال قالب PDMS. باستخدام ثاقبة عينات، نظف قالب PDMS بنقعه في ethanol بتركيز 70% لمدة 30 دقيقة، ثم شطفه بالماء منزوع الأيونات لمدة 10 دقائق. قم بتعقيم وإكمال تفاعلات التشابك المتقاطع لقالب PDMS عن طريق التعقيم بالبخار (autoclaving).

الآن، ضع ختم PDMS على شريحة غطاء زجاجية مغطاة بـ poly L lysine. بعد ذلك، يتم طلاء الجهاز بـ laminate عن طريق ملء الغرف بمحلول laminate من خلال مداخل الخزان، ثم يُحضن طوال الليل عند 37 °C. وفي اليوم التالي، قم بسحب laminate من الجهاز.

ثم اغسل الجهاز عن طريق غمره مرتين بوسط زراعة الخلايا الجذعية. والآن، حمّل 11 µL من الخلايا المفككة في أحد خزانات الاستزراع. وإذا لزم الأمر، استخدم الشفط بالتفريغ لدفع الخلايا إلى داخل الغرفة. ثم حمّل سبعة µL إضافية من الخلايا في خزان الاستزراع المجاور.

بعد مرور خمس دقائق، ستغمر الأوساط الغذائية خزانات التثبيت والاستقبال. الآن، ضع شريحة PDMS معقمة بسماكة تتراوح من 0.5 إلى 1 مليمتر على الجهاز. سيعمل الالتصاق السطحي الطبيعي لـ PDMS مع نفسه على إغلاق الجهاز، وبمجرد إغلاقه، يصبح جاهزاً للنقل والحضن والتصوير المجهري.

قم بموازنة درجة حرارة الحاضنة (biot, IM) مسبقاً عن طريق تشغيلها لمدة 45 دقيقة. ولتثبيت درجة الحرارة والرطوبة وإمدادات الهواء، أضف عدة أطباق من الماء إلى حجرة العينات للحصول على الرطوبة المناسبة. ضع الجهاز المُجهّز في حجرة عينات المجهر.

قم بتوسيط الجهاز باستخدام ملاقط دقيقة. الآن، حدد نقاط موضع التركيز والنقاط الزمنية باستخدام برنامج Biot وابدأ تسجيلات التصوير الزمني إذا لزم الأمر. بعد مرور خمسة أيام من الزرع، استبدل الوسط الغذائي.

تم تسجيل الخلايا التوتيرية الدماغية (BTCs) المستزرعة في الجهاز باستمرار باستخدام صور الطور. وعلى مدار خمسة أيام في غرفة الاستقرار، ظلت الخلايا مغزلية الشكل في مرحلة ما قبل الهجرة. وعندما اقتربت من مدخل القناة الدقيقة، تمددت بعض الخلايا وولدت بروزات لاصقة.

تمكنت خلية واحدة فقط من احتلال المدخل واستكشاف اتجاه الهجرة. وبمجرد أن حددت الخلية اتجاه الهجرة، شرعت في التحرك عبر القناة الدقيقة بأكملها بسرعة عالية وثابتة. وعند نهاية القناة الدقيقة، قامت الخلية باستكشاف المساحة المفتوحة في غرفة الاستقبال قبل الدخول إليها في النهاية.

من خلال مراقبة الخلايا بفترات تصوير ثانية متباعدة، تبين أن قوة الهجرة كانت ناتجة بشكل أساسي عن نشاط التذبذب (blabbing) المشابه لذلك الموجود في خلايا OID. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن تصميم الجهاز مرن للغاية بحيث يمكن التحكم في أبعاد القناة الدقيقة لتحقيق درجة الهجرة الخلوية المطلوبة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء جهاز ميكروفلويديك مقسم فريد ومناسب لاستزراع الخلايا المستهدفة، ومن ثم إجراء تصوير ممنتج طويل الأمد لتحديد الخصائص الهجرية لهذه الخلايا نوعياً وكمياً باتباع هذا الإجراء.

يمكن تطبيق طرق أخرى مثل تسلسل الجيل القادم أو المصفوفات الدقيقة للحمض النووي DNA للإجابة على أسئلة إضافية، مثل مدى الاختلاف الجيني للخلايا السرطانية عالية الهجرة.