الهندسة البكتيريا تمسكا من إنشاء واحدة الاصطناعية Curli OPERON

الهدف العام من التجربة التالية هو إكساب البكتيريا خصائص التصاق من أجل تسهيل فصلها عن الأوساط السائلة. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تصميم curli اصطناعي لتجاوز التنظيم الجيني المعقد وتمكين الإنتاج السهل والواسع للبوليمرات اللاصقة. وكخطوة ثانية، يتم تصوير وقياس البكتيريا الملتصقة على البوليسترين، مما يسمح بتقدير سريع لكفاءة الجهاز الاصطناعي.

بعد ذلك، يتم تصور البكتيريا الملتصقة على الزجاج باستخدام المجهر البؤري. وبغرض الملاحظة المباشرة للغشاء الحيوي والحصول على معلومات حول بنيته، تم الحصول على نتائج تظهر زيادة ملحوظة في الالتصاق في السلالة التي تحمل الجهاز الاصطناعي، وذلك بناءً على قياسات نسبة الالتصاق والملاحظات المجهرية. وتتمثل الميزة الرئيسية لمنهج البيولوجيا الاصطناعية مقارنة بالطرق الحالية مثل الاستنساخ التقليدي، في إمكانية الحصول بسرعة كبيرة على بناء جيني يحتوي فقط على الجينات المطلوبة بدقة مع الإشارات المناسبة.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على سؤال رئيسي في مجال المعالجة الحيوية، مثل معالجة تحدي إزالة البكتيريا المحملة بالمعادن من النفايات المشعة. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأن الأمر يتطلب معرفة أساسية بإشارات التنظيم الجيني والتعامل مع قواعد البيانات. سيركز العرض المرئي على القياس الكمي وتصوير الغشاء الحيوي (biofilm)، نظراً لأن هاتين الخطوتين يصعب تعلمهما بسبب هشاشة الأطر الحيوية (bioframes).

تتمثل الخطوة الأولى في تصميم الـ carron الاصطناعي في تحديد التنظيم الجيني لجينات الـ curly وتحديد إشاراتها الداخلية والنسخية والترجمية. ويتم تحقيق ذلك باستخدام قواعد بيانات متخصصة مثل REON DB أو eco gene. والخطوة التالية هي اختيار الجينات الخمسة المطلوبة تماماً لتخليق الـ curly، وهي CSGB و CSGA اللذان يشفران مونومرات الألياف، و C-S-G-E و C-S-G-F و CSGG التي تشفر معقد إفراز الـ curling، ثم استخراج التسلسلات المختارة من قاعدة البيانات بتنسيق faster لإدارة البيانات، وسيتم إجراء تحليل أولي في silico باستخدام برنامج clone manager نظراً لأن عنقود C-S-G-G-F-E يكون في الاتجاه المضاد (antisense) في جينوم e coli.

يجب تحويل هذا التسلسل إلى نظيره المتمم العكسي. استخدم أدوات مدير الاستنساخ (clone manager) عبر عملية "invert molecule" لجزيء العملية، ثم قم بلصق التسلسل C-S-G-E-F-G خلف C-S-G-B-A باستخدام وظيفة "ligate". بعد ذلك، أضف المحفز المناسب PRCN أمام تسلسل iCal الخاص بـ C-S-G-B-A-E-F-G.

يشفر الموقع RCN مضخة FLX تُدعى RCNA، وهي المسؤولة عن إزالة سمية النيكل والكوبالت، والمنظم المعدني المرتبط بها RCNR. في حالة غياب الكوبالت أو النيكل، يرتبط الكابت RCNR بصندوق RCNR الموجود على الحمض النووي DNA ويمنع التنشيط الكامل لعملية نسخ الجينات الموجودة في المصب. وإذا ارتفع التركيز داخل الخلايا من الكوبالت أو النيكل، فإن ارتباط الكوبالت أو النيكل ببروتين RCNR يمنع تثبيت الكابت بالمحفز، مما يزيد من النشاط النسخي لـ P-R-C-N-A عن طريق وضع الجينات الخمسة المختارة تحت تحكم المحفز.

يُتوقع أن يتم إنتاج PRCN curly بكميات زائدة في وجود الكوبالت والنيكل. بعد ذلك، يتم تحسين إشارات النسخ عن طريق إضافة موقع ارتباط ريبوسومي مثالي أو RBS أمام أول A TG من تتابع DNA الخاص بـ CS gba، وإضافة RBS مثالي ثانٍ أمام تتابع C-S-G-E-F-G. لكي يتوافق الجهاز مع معايير I GMs، يجب أن يكون محاطاً ببادئة bio brick قياسية تحتوي على مواقع قطع لـ ECO R one وX-bar one، ولاحقة تحتوي على مواقع قطع لـ SPE one وPST one لتسهيل عملية التجميع اللاحقة.

قد لا يحتوي جزء الطوبة الحيوية (bio brick) نفسه على أي مواقع تعرف لـ ECO R one أو PST one أو SPE one أو X-bar R one. وبناءً على ذلك، تمت إزالة هذه المواقع عن طريق تغييرات طفرات صامتة؛ حيث كشف تحليل التقييد الحاسوبي (in silico) للجهاز عن وجود موقع PST one واحد في تسلسل CSGA، وموقع PST one واحد في تسلسل RCNR، وموقع ECO R one واحد في جين CSGE. وقد تم تعديل هذه المواقع بواسطة طفرات صامتة.

بمجرد اكتمال تصميم الأوبيرون الاصطناعي، قم بإجراء محاكاة للترجمة باستخدام برنامج مدير الاستنساخ (clone manager). استخدم برنامج محاذاة التسلسلات blast للتحقق من وجود تماثل تام بين بروتينات curly من النوع البري والبروتينات المشفرة بواسطة الأوبيرون الاصطناعي. لبدء هذا الإجراء، ابدأ بكل بئر من ألواح البوليسترين ذات الـ 24 بئرًا باستخدام 2 مل من الوسط الأدنى M 63 مع 0.2% glucose. قم بتلقيح كل بئر بـ 10⁶ خلية من مزرعة بكتيرية ملقحة ليلة كاملة. قم بتنمية البكتيريا عند 30 °C لمدة تتراوح بين 18 و 48 ساعة دون هز. يمثل كل عمود في لوح الـ 24 بئرًا نمطًا معينًا.

تتم إضافة الكمية المناسبة من الكوبالت والمضاد الحيوي عند الحاجة. تُستخدم الصفوف الثلاثة الأولى لتقدير كمية البكتيريا الملتصقة A عن طريق حساب متوسط التكرارات الثلاثة. ويُستخدم الصف الأخير جهة اليسار لتصوير الغشاء الحيوي عن طريق صبغ الكريستال البنفسجي بعد مرور 18 إلى 48 ساعة، ثم يتم استعادة السائل الطافي الذي يحتوي على الخلايا السابحة من كل بئر في الصفوف الثلاثة الأولى من لوحة الـ 24 بئراً ونقل السائل الطافي إلى أنبوب تحليل الدم.

اغسل كل بئر بعناية باستخدام 1 mL من الوسط M 63، ثم اسحب سائل الغسيل في أنبوب تحلل الدم باستخدام الماصة الأولية. يُشار إلى هذا المجمع باسم الخلايا السابحة ويُرمز لها بالرمز S. تكون قيعان الآبار في الصفيحة الدقيقة مغطاة بالخلايا الملتصقة. ولاستعادة الغشاء الحيوي الرقيق، أضف 1 mL من M 63 في كل بئر.

قم بكشط العينة باستخدام طرف الماصة، ثم اسحب السائل للأعلى والأسفل بالماصة وانقل جزء الغشاء الحيوي إلى أنبوب تحلل دموي جديد. قم برج الأنبوب باستخدام جهاز الفورتكس لمدة 15 ثانية. اجمع أجزاء الغشاء الحيوي في أنابيب تحلل دموي.

يمثل هذا الحوض الخلايا الملتصقة بالسطح المسماة B؛ انقل 200 µL من الجزء العلوي وجزء الغشاء الحيوي (biofilm) من أنابيب التحلل إلى طبق يحتوي على 96 بئراً. قدّر عدد البكتيريا الملتصقة بالسطح والبكتيريا السابحة من خلال الكثافة الضوئية عند 600 nm. تُحسب نسبة الالتصاق لكل نمط باستخدام الصيغة B مضروبة في 100 مقسومة على 3 مضروبة في S زائد B. لتصور الغشاء الحيوي في الصف الأخير فقط من طبق الـ 24 بئراً، تخلص من الخلايا العالقة (plankton cells) من تلك الآبار.

أضف 1 mL من M 63 إلى كل بئر لشطف الغشاء الحيوي الذي تشكل في قاع الطبق. جفف الطبق المكشوف لمدة ساعة واحدة عند 80 °C، وبعد مرور ساعة، أضف 100 µL من crystal violet بتركيز 20% إلى كل بئر، تليها عمليات غسل مكثفة بالماء. يتطلب هذا البروتوكول وجود chassis فلوري.

يُعد سلالة e coli SCC one مضيفاً مناسباً للبلازميد الحامل لـ curly الاصطناعي، حيث تقوم هذه السلالة بالتعبير التلقائي عن البروتين الفلوري الأخضر دون وجود فرق ملحوظ مقارنة بالسلالة الأم MG 1 16 55. قم بتحويل السلالة المضيفة باستخدام بلازميد puck 57 الحامل لـ curli الاصطناعي للحصول على السلالة S 23. قم بتحويل السلالة المضيفة باستخدام بلازميد التحكم puck 18 للحصول على سلالة التحكم.

قم بزراعة مستنبتات أولية مبيتة لسلالتي S 23 و S 24 عند درجة حرارة 30 °C في وسط M 63 المكمل بالجلوكوز والأمبيسيلين. وفي اليوم التالي، أضف 20 milliliters من وسط M 63 إلى طبق بتري، ثم قم بتلقيح 15 milliliters من وسط M 63 في أطباق بتري باستخدام 100 µL من المستنبتات الأولية. أضف التركيز المناسب من الكوبالت، ولا تنسَ تحضير العينة الضابطة السالبة الخالية من الكوبالت.

ضع ثلاث شرائح غطاء زجاجية مستطيلة في كل طبق بتري. قم بتحضين الأطباق طوال الليل عند 30 درجة Celsius دون رج. يمكن معاينة البكتيريا مباشرة تحت المجهر الفلوري في الأيام التالية.

من المهم تجنب جفاف العينة، لذا يجب تنفيذ الخطوات التالية بعناية وبسرعة. قم بإزالة كل غطاء شريحة من أطباق Petri وقم بتصريفه بعناية. نظف الوجه السفلي بعناية باستخدام مسحة قطنية صغيرة مبللة بـ 70%ethanol لمسح جميع البقايا البكتيرية من أجل الفحص بالمجهر البؤري (confocal observation).

ضع شريحة الغطاء على شريحة زجاجية بحيث يكون الوجه العلوي المغطى بالغشاء الحيوي (biofilm) متجهاً للأعلى. بعد ذلك، يتم تغطية الغشاء الحيوي بشريحة غطاء أكبر، والتي يتم تثبيتها على الشريحة الزجاجية باستخدام الورنيش.

اقلب التجهيزات بحيث يصبح الغشاء الحيوي الآن على الوجه السفلي. ضع التجهيزات تحت المجهر الليزري البؤري في هذه التجربة. يتم استخدام مجهر ليزري بؤري من طراز Zeiss LSM 510 Meta ضمن منصة CT micro.

اختر العدسة الشيئية ذات التكبير 40x المغمورة في الزيت. استخدم الإعدادات التالية: استحث GFP عند 488 nanometers واجمع التألق البكتيري في المدى من 500 إلى 600 nanometers. استخدم العدسة الشيئية ذات التكبير 40x المغمورة في الزيت لالتقاط الصور.

في وضع المجهر البؤري الماسح بالليزر، يتم مسح الهياكل ثلاثية الأبعاد الشاملة للأغشية الحيوية من السطح الصلب وصولاً إلى الواجهة مع وسط النمو، باستخدام خطوة قدرها 1 micron.

قم بإجراء إسقاطات ثلاثية الأبعاد باستخدام برنامج maus، وحدد سُمك الغشاء الحيوي (biofilm) من خلال تحليل متوسط قيمة C على طول المقاطع الطولية الإحصائية. يمكن استخلاص كميات الغشاء الحيوي وأحجام الكتلة الحيوية من مجموعات الصور البؤرية المتراصة (Z stacks) المأخوذة بالمجهر البؤري. ويمكن تقييم قدرات الالتصاق لبكتيريا e coli المهندسة لزيادة إنتاج curly استجابةً للمعدن باستخدام طرق بسيطة.

على سبيل المثال، يتيح صبغ الكريستال البنفسجي في أطباق Irene المصقولة ذات الـ 24 بئراً تصوراً سريعاً لتشكّل الغشاء الحيوي الرقيق في قاع كل بئر، كما يتضح من الاختلاف في كثافة اللون الأرجواني. ويبدو أن السلالة البرية أقل التصاقاً من السلالة المعدلة وراثياً. وتتمثل الطريقة الكمية في قياس نسب الالتصاق بالبوليسترين للسلالات البرية والمعدلة وراثياً مع تركيزات مختلفة من الكوبالت.

تكشف النتائج المعروضة في هذا الرسم البياني أن نسبة التصاق السلالة المهندسة أعلى بمقدار 1.5 ضعف من نسبة التصاق السلالة البرية في غياب الكوبالت. بالإضافة إلى ذلك، لوحظ تعزيز كبير للالتصاق مع زيادة تركيزات الكوبالت؛ ففي الأوساط التي بلغت تركيزات الكوبالت فيها 25 micromolar أو 50 micromolar، وصلت نسب التصاق الخلايا المهندسة إلى 30% و 40% على التوالي. كما يمكن مقارنة قدرات الالتصاق باستخدام المجهر مع بكتيريا موسومة بـ GFP مستزرعة على شرائح زجاجية، حيث تكشف ملاحظات مجهر الفلورسنت فوق البؤري (epi fluorescence microscopy) للبكتيريا الخضراء على خلفية سوداء أن السلالة المهندسة تشكل غشاءً حيويًا (biofilm)، بينما تشكل السلالة البرية مستعمرات مجهرية فقط كما تشير الأسهم.

يوفر تحليل المجهر البؤري (Confocal microscopy) رؤية شاملة للبنية ثلاثية الأبعاد للغشاء الحيوي (biofilm). تظهر عمليات إعادة بناء المنظور العلوي في اللوحات A، بينما تظهر عمليات إعادة بناء المنظور الجانبي في اللوحات B. وتؤكد النتائج أن السلالة المهندسة أكثر التصاقاً وتُشكل غشاءً حيوياً أكثر كثافة وسماكة من النوع البري. وعند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم مراجعة تصميم العملية بدقة، على سبيل المثال، لاستكشاف إمكانات الوساطة الحيوية لـ e coli المعدلة أو occus ants في سياق مياه الصرف المشعة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم ميركبة تخليقية باستخدام برنامج مدير الاستنساخ (clone manager software) وكيفية التحديد الكمي السريع للتعبير في السلالات البكتيرية. لا تنسَ أن العمل مع الجينات التخليقية والكائنات المعدلة وراثياً قد يكون خطيراً للغاية؛ لذا يجب أن تخضع هذه العمليات للقوانين الحالية، كما يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة أثناء تنفيذ هذا الإجراء، مثل تعقيم البكتيريا المحولة بواسطة الموصدة (autoclaving).