كيميائيا سدت [ميكروأري] لتحديد ملامح عالية الإنتاجية من تعدد في الإرسال ارتباط بالغليكوزيل بروتين معين في عينات مجمع

تصف هذه المقالة المرئية إجراءً للحصول على ملفات تعريف الارتباط السكري لـ 20 بروتيناً سكرياً مختلفاً في عينة مصل مريض مصاب بسرطان الخلايا الكبدية باستخدام مصفوفة ميكروية من الأجسام المضادة المحجوبة كيميائياً. أولاً، تُطبع الأجسام المضادة النوعية للبروتينات السكرية مباشرة على شرائح المصفوفة الميكروية، ويتم حجب الغليكانات الموجودة في الأجسام المضادة لمنع ارتباط اللكتين بها. وعند وضع عينات مصل المريض، تلتقط الأجسام المضادة البروتينات السكرية الموجودة في العينة. بعد ذلك، تُضاف بروتينات ربط الغليكان المرتبطة بالبيوتين للكشف عن الغليكانات، ثم يُضاف neu travain المقترن بالـ di لوسم اللكتينات المرتبطة بالبيوتين.

يتم بعد ذلك مسح شريحة المصفوفة الدقيقة للكشف عن الفلورية، ويكشف تحليل البيانات الناتجة عن ملفات الارتباط السكري لبروتينات العينة. وتتميز هذه التقنية بعدة مزايا مقارنة بالطرق الحالية مثل HPLC. تتيح هذه الطريقة الكشف عن البروتينات السكرية الفردية في حالتها الأصلية.

إن إجراء مسح للتغيرات في عملية الغلكزة لبروتينات متعددة في وقت واحد يعد أمراً أسرع وأسهل. لقد وجدنا أن المؤشرات الحيوية للأمراض، ولا سيما السرطان وسرطان الكبد، والتي درسنا وضعها بعناية فائقة، غالباً ما تكون مغلکزة. كما وجدنا أن القدرة على اكتشاف أشكال غلكوزية محددة تعزز بشكل كبير من أداء المؤشرات الحيوية من حيث حساسيتها وخصوصيتها.

وبالتالي، يمكن لهذا القياس أن يوفر رؤى حول تغيرات الغليكوزيل (glycosylation) في العديد من بروتينات المصل في سرطان الخلايا الكبدية (HCC). كما يمكن تطبيقه على الدراسات الباثولوجية واكتشاف المؤشرات الحيوية في سرطانات وأمراض أخرى، مثل سرطان البنكرياس والسكري ومرض ألزهايمر. ستقوم تشين لو، وهي فنية من مختبري، باستعراض هذا الإجراء.

ابدأ هذا البروتوكول بتجهيز المصفوفة الدقيقة للأجسام المضادة أولاً؛ في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 0.8 milliliter على الثلج، خفف جميع الأجسام المضادة التي ستُستخدم في طباعة المصفوفة الدقيقة إلى تركيز 0.5 milligrams per milliliter في 40 milliliters على الأقل من PBS، وهنا سيتم استخدام 26 جسماً مضاداً مختلفاً كضوابط إيجابية. قم أيضاً بتجهيز نفس الكمية من BSA المبيوتني (biotinylated BSA) بتركيز 0.5 milligrams per milliliter في PBS. استخدم الماصة لتوزيع 40 milliliters من كل جسم مضاد في لوحة المصدر ذات 384 بئراً على الثلج.

بعد ذلك، قم بتحديد موقع كل جسم مضاد في برنامج التحكم في المصفوفات الدقيقة. ثم، ضع اللوحة في جهاز المصفوفات الدقيقة كمصدر. بعد ذلك، قم بتحميل 20 شريحة مصفوفة دقيقة للمسارات في جهاز المصفوفات الدقيقة كهدف.

اضبط مصفوفة الدقيق لطباعة 48 مصفوفة فرعية متطابقة، حيث يتم توزيع 27 من الأجسام المضادة وبروتينات التحكم في ثلاث نسخ مكررة وفق نمط تسعة في تسعة. ابدأ عملية طباعة شرائح مصفوفة الأجسام المضادة. اجمع شرائح مصفوفة الأجسام المضادة وقم بتخزينها في علبة شرائح تحتوي على مادة مجففة.

أغلق الكاسيت في كيس بلاستيكي لمنع تمسخ البروتين وتكون الرطوبة على الشرائح أثناء التخزين. تُحفظ شرائح المصفوفة الدقيقة المغلقة عند درجة حرارة 4 °C حتى وقت استخدامها. إن الجانب الأكثر صعوبة وأهمية في هذا الإجراء هو خطوة الحجب الكيميائي.

لضمان النجاح، من الضروري طباعة كمية كافية من الأجسام المضادة على شريحة المصفوفة الدقيقة. قم دائمًا بتحضير sodium IDE و agro acid hydrocyte طازجين قبل التجربة مباشرة. وتأكد من إجراء عملية الأكسدة عند درجة حرارة 4 °C مع تجنب الضوء.

أخرج شرائح المصفوفات الدقيقة من الثلاجة واتركها حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. أخرج شريحة واحدة من صندوق التخزين. اغمر الشريحة لفترة وجيزة في حوض غسيل يحتوي على PBS مع 0.1% tween 20.

بعد ذلك، اغمر الشريحة في محلول منظّم من خلات الصوديوم بتركيز 15 millimolar مع 0.1% tween لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، قم بتحضير محلول طازج من بيرودات الصوديوم بتركيز 150 millimolar في محلول منظّر من خلات الصوديوم بتركيز 15 millimolar، وانقله إلى حوض غسيل الشرائح. يُحفظ في الثلاجة، بعيداً عن الضوء حتى وقت الاستخدام. أخرج الشريحة من محلول خلات الصوديوم المنظّر وضعها في الحوض الذي يحتوي على بيرودات الصوديوم الطازجة بحيث يكون جانب الأجسام المضادة متجهاً للأعلى.

قم بتغطية الحوض بورق الألومنيوم لتجنب الضوء. ثم ضع حوض الشرائح عند درجة حرارة 4 °C مع الرج اللطيف لمدة ساعتين. أخرج الشريحة من الحوض واشطفها سريعاً في محلول منظم من خلات الصوديوم ثلاث مرات لمدة خمس دقائق.

قم بتحضين الشريحة في 300 milliliters من محلول حجب حمض الغلوتاميك المائي (hydro glutamic acid) بتركيز 10 millimolar المُحضّر حديثاً داخل غرفة تحضين لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع الرج اللطيف. أخرج الشرائح من الغرفة واغسلها باستخدام PBS مع 0.1%tween لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك، في حوض غسيل الشرائح، قم بتحضين شريحة المصفوفة الدقيقة (microarray) في 300 milliliters من 1%BSA في PBS مع 0.5%tween لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الرج اللطيف.

اشطف الشرائح في محلول PBS مع 0.1%tween ثلاث مرات لمدة ثلاث دقائق. ضع الشريحة على حامل شرائح وقم بتدويرها بسرعة 1,200 ×g لمدة دقيقتين لتجفيف شريحة المصفوفة الدقيقة بعد ذلك. وللعمل على فصل كل مصفوفة فرعية، يتم طباعة شبكة شمعية على الشريحة.

بعد تسخين طابعة الشمع مسبقاً عند 70 درجة Celsius لمدة خمس دقائق، ضع شريحة المصفوفة الدقيقة المحجوبة في طابعة الشمع بحيث يكون جانب الأجسام المضادة مواجهاً للشمع. اسحب المقبض برفق لطباعة الشمع بالتساوي على الشريحة. يمكن استخدام هذه الطريقة لإجراء مقاييس التنميط السكري لعينة واحدة أو لقياس متمطّن سكري واحد في عينات متعددة.

سنقوم هنا بتوضيح مقاييس التوصيف السكري. ابدأ بتخفيف 40 µL من المصل في 360 µL من PBS يحتوي على 0.1%tween 0.1%bridge 35 و 100 µg/mL من كل من IgG الخاص بالفأر، والجرذ، والأرنب، والماعز، والحمار. هذا الحجم كافٍ لوضع 6 µL من محلول المصل المخفف على كل مصفوفة فرعية.

ضع بعناية 6 µL من العينة المخففة أو الضابطة على كل مصفوفة فرعية من الشريحة. حضّن الشريحة في كاسيت مرطب مع مناشف ورقية مبللة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. اشطف الشريحة باستخدام PBS يحتوي على 0.1% tween ثلاث مرات لمدة ثلاث دقائق.

بعد ذلك، جفف الشريحة عن طريق تدويرها بسرعة 1200 ×g لمدة دقيقتين. قم بتحضير 20 µL من البروتينات الرابطة للجليكان المبيوتنة بتركيز 10 mg/mL في محلول PBS tween في أنبوب طرد مركزي سعة 0.8 mL على الثلج. ضع 6 µL من الليكتينات المبيوتنة المخففة على كل مصفوفة فرعية من الشريحة، ثم حضنها في صندوق شرائح مرطب مع مناشف ورقية مبللة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

بعد شطف الشرائح بمحلول PBS مع 0.1%tween ثلاث مرات كما سبق، جفف الشريحة عن طريق تدويرها بسرعة 1200 times G في جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين. قم بتحضير 400 µL من DITE 5 49 labeled neut travain بتركيز 10 mg/mL في محلول PBS 0.1%tween داخل أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.8 mL على الثلج. استخدم ماصة تكرارية لوضع 6 µL من DITE 5 49 labeled neut travain على كل مصفوفة فرعية، ثم حضن الشريحة في كاسيت شرائح مرطب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة بعد عملية التحضين.

اشطف الشريحة بمحلول PBS 0.1%tween ثلاث مرات لمدة ثلاث دقائق. جفف الشريحة عن طريق تدويرها بسرعة 1200 times G في جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين. قم بمسح الشريحة باستخدام ماسح مصفوفات دقيقة فلوري بدقة 10 millimeter.

يجب أن تكون إعدادات الليزر والأنبوب المضاعف 광الكهربائي (PMT) قوية قدر الإمكان مع ضمان عدم حدوث تشبع. افتح الصورة في برنامج array Pro 3.2. قم بإعداد قالب المصفوفة وفقاً لخريطة المصفوفة التي توضح مواقع بقع الأجسام المضادة.

قم بمحاذاة كل دائرة قالب بدقة فوق البقعة المقابلة لها في الصورة، ثم استخرج شدة كل بقعة في ملف Excel لإجراء المزيد من التحليلات. تم تصميم وتصنيع مصفوفة ميكروية للأجسام المضادة تحتوي على 48 مصفوفة فرعية متطابقة تضم 26 جسماً مضاداً ضد 20 بروتيناً سكرياً في المصل و BSA المرتبط بالبيوتين، كما هو موضح في هذا الفيديو لفحص أهمية إجراء الحجب.

في تحليل توصيف البروتينات السكرية، تم تحضير شريحتين متطابقتين من المصفوفات الدقيقة. لم يتم حجب إحداهما كيميائياً، بينما تم تطبيق عينة ضابطة على المصفوفات الفرعية في العمودين الأول والثالث، ووُضعت عينة مجمعة من مصل سرطان الخلايا الكبدية HCC على المصفوفات الفرعية في العمودين الثاني والرابع 22.

تم بعد ذلك تطبيق الليكتينات المبيوتنلة (Biotinylated lectins) المتخصصة في جليكانات مختلفة على كل مصفوفة فرعية كما هو موضح في هذه الصور للمصفوفات الفرعية. ارتبطت الليكتينات بالأجسام المضادة الالتقاطية في أعمدة التحكم، مما أدى إلى ظهور خلفية عالية لا يمكن تمييزها عن الأعمدة المحملة بالمصل في المصفوفات الدقيقة غير الموقوفة. ومع ذلك، عندما أجريت التجربة نفسها على شريحة مصفوفة أجسام مضادة موقوفة كيميائياً، لم يكن هناك ارتباط أو كان هناك ارتباط منخفض جداً بالأجسام المضادة الالتقاطية في أعمدة التحكم، بينما كان هناك ارتباط عالٍ للمستضدات في الأعمدة المحملة بالمصل.

تثبت هذه النتائج أن إجراء الحجب الكيميائي خطوة حاسمة لقياس الغليكانات في البروتينات السكرية التي يتم التقاطها بواسطة الأجسام المضادة. ومن خلال اتباع هذا البروتوكول، يمكن الحصول على ملفات تعريف الغلكزة لـ 22 بروتيناً سكرياً في مصل سرطان الخلايا الكبدية (HCC) بمجرد إتقان الطريقة. ويمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون ثماني ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. وقد تفقد الأجسام المضادة ألفتاها تجاه مستضداتها وخصائص أخرى عند تعديلها.

لذا، من المهم وضع ذلك في الاعتبار واستخدام عدة أجسام مضادة مختلفة من مصادر متنوعة عند اتباع هذا الإجراء. ويمكن تنفيذ تدابير أخرى، مثل قياس تركيز كل بروتين باستخدام شريحة المصفوفة الدقيقة ذاتها، وذلك للإجابة على أسئلة إضافية، مثل ما إذا كان التغيير في عملية الغلوزة ناتجاً عن تغير في مستويات التعبير البروتيني أو ناتجاً فقط عن تغير الغلوزة في كل بروتين على حدة. ولا تنسَ أن التعامل مع عينات المصل التي تحتوي على مسببات الأمراض قد يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل ارتداء القفازات الواقية، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.