تفاعل البلمرة سلسلة: البروتوكول الأساسي زائد استراتيجيات حل المشكلات والتحسين

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح الخطوات المتبعة في تفاعل البوليميراز المتسلسل أو PCR، والذي يُستخدم لإنتاج كمية وافرة من قطعة محددة من DNA من كمية صغيرة من المادة البادئة. أولاً، يتم تجميع الكواشف والمواد التي ستُستخدم في تفاعل PCR، ثم يتم تحضير خليط التفاعل، بما في ذلك نيوكليوتيدات ديوكسي ريبونيوكليوتيد الأربعة، وقالب DNA، والبادئات، وإنزيم DNA polymerase. بعد ذلك، يتم برمجة ظروف الدورات الحرارية وتشغيل تفاعل PCR.

بعد ذلك، تحقق من النتائج لتحديد ما إذا كان التفاعل قد تم بنجاح. وفي النهاية، يجب أن ينتج عن تفاعل البوليميراز المتسلسل قطعة تضخيم محددة بالحجم المطلوب للمنتج.

بشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذا البروتوكول بعض الصعوبة في إعداد حسابات كل كاشف متغير، وأحياناً يواجهون مشكلات في عملية الماصة، وفي تحديد الأحجام الصحيحة، لا سيما مع البوليميراز الذي يحتوي على الجلسرول. ابدأ التجربة بدلو ثلج مملوء حديثاً. ارتدِ القفازات لتجنب تلوث التفاعل.

المزيج والكواشف. رتّب مكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على الثلج لتذوب تماماً. وتشمل هذه المكونات بادئات قالب DNA، وإنزيم DNA polymerase، ومحلول التفاعل المنظم (10 x reaction buffer) بوجود أو غياب كلوريد المغنيسيوم، والديوكسي نوكليوتيدات، والماء المعقم، وكلوريد المغنيسيوم.

يكون كلوريد المغنيسيوم مطلوباً في حال استخدام المحلول المنظم الخالي من كلوريد المغنيسيوم. ضع طبقاً ذا 96 بئراً في دلو ثلج ليكون بمثابة حامل لأنابيب PCR رقيقة الجدران سعة 0.2 milliliter. والآن، جهز طاولة العمل بأنابيب وأغطية PCR.

حامل أنابيب PCR، وعلامة مقاومة للإيثانول، ومجموعة من الماصات الدقيقة. قم دائمًا بإنشاء جدول للكواشف يوضح تفاصيل خليط التفاعل مع إضافة كمية من الماء المقطر المعقم للوصول إلى حجم نهائي قدره 50 µL. على سبيل المثال، استخدام 5 µL من محلول منظم بدون المغنيسيوم، و1 µL من dNTPs بتركيز 10 mM، ومغنيسيوم مُحسَّن بتركيز 4.0 mM.

ميكرولتر واحد من كل بادئ بتركيز 20 ميكرومولار، و0.5 ميكرولتر من قالب بتركيز اثنين نانوغرام لكل ميكرولتر، و0.5 ميكرولتر من البوليميراز، مما يتطلب إضافة 33 ميكرولتر من الماء المعقم فقط. أضف كلوريد المغنيسيوم إذا لم يكن موجوداً في المنظم بتركيز 10x أو إذا كانت هناك حاجة لتحسين تفاعل PCR.

باشر بتعليم أنابيب PCR باستخدام قلم تحديد مقاوم للإيثانول على كل أنبوب تفاعل. أولاً، أضف الكميات المحسوبة من الماء المعقم، ثم أضف 10 x buffer و 10 millimolar DN NTPs. بالنسبة لهذا التفاعل، سنقوم بإجراء معايرة باستخدام كلوريد المغنيسيوم.

بما أن تركيز المغنيسيوم لن يكون ثابتاً، يُضاف كلوريد المغنيسيوم إلى أنابيب PCR بشكل فردي، ويُضبط الحجم إلى 10 microliters باستخدام ماء معقم، بحيث تُضاف 40 microliters من المزيج الرئيسي النهائي إلى كل أنبوب PCR. ولإكمال تفاعل الـ 50 microliter وكلوريد المغنيسيوم، استمر في إضافة قالب DNA والبادئات. وأخيراً، أضف من 0.5 إلى 2.5 units من إنزيم DNA polymerase لكل تفاعل بحجم 50 microliter في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.8 milliliter.

قم بتحضير محلول المزيج الرئيسي (master mix) بكمية كافية لتغطية العينات الضابطة بالإضافة إلى الفاقد الناتج عن النقل بالماصة. اضبط الماصة الدقيقة على حوالي نصف الحجم الكلي للمحلول، ثم اخلطه برفق عن طريق السحب والدفع بالماصة. قم بتوزيع المزيج الرئيسي بدقة في أنابيب PCR لكل عينة اختبار.

أما بالنسبة للضابط السلبي الخالي من الحمض النووي القالب، فأضف جميع الكاشفات واستخدم الماء المعقم لتعويض حجم الحمض النووي المفقود. ثم بالنسبة للضابط الإيجابي، استخدم مجموعة من الحمض النووي القالب والبادئات التي تضخم قطعة معروفة تحت نفس ظروف عينات PCR التجريبية. تقوم أجهزة التدوير الحراري لـ PCR بتسخين وتبريد خليط التفاعل بسرعة، مما يسمح بمسخ الازدواج الناجم عن الحرارة، وارتباط البادئات بشريطي الحمض النووي القالب الموجب والسالب، واستطالة ناتج PCR.

تعتمد أوقات الدورات على حجم القالب ومحتوى GC في DNA وفقاً للصيغة العامة. ابدأ بعملية مسخ أولية للقالب، ثم ابدأ من 25 إلى 35 دورة من برنامج دورات حرارية مكون من ثلاث خطوات. تتمثل الخطوة الأولى من هذه الدورات في مسخ قالب DNA.

ثم قم ببرمجة درجة حرارة الارتباط المثلى، بحيث تكون أقل بنحو خمس درجات مئوية من درجة حرارة الانصهار الظاهرية للبادئات، تليها خطوة الاستطالة لجلب إنزيم البوليميراز إلى قالب DNA وتخليق ناتج PCR. والآن أدخل عدد الدورات. ثم انتقل إلى البرنامج التالي.

خطوة استطالة ممتدة لإتمام تخليق نواتج التضخيم (amplicons). وأخيراً، قم بتضمين خطوة إنهاء عن طريق تبريد الخليط إلى 4 °C. إذا لم تؤدِ ظروف PCR القياسية إلى الحصول على ناتج التضخيم المطلوب، فإن تحسين PCR ضروري لتحقيق نتائج أفضل.

لذا، إذا لم تنجح التفاعلات في المرة الأولى، يجب محاولة استكشاف أخطاء التفاعل وإصلاحها. وأولاً، عليك التأكد من أن المشكلة لم تكن ناتجة عن خطأ بشري؛ وقد يحدث ذلك في حالة وجود خطأ في عملية الماصة (pipetting) أو إذا نسيت إضافة كاشف إلى أحد أنابيب الاختبار.

بعد ذلك، يمكنك محاولة تغيير بعض معايير صرامة الظروف لتعديل إعدادات جهاز الدورات الحرارية، أو يمكنك تغيير تركيز المغنيسيوم كطريقة بديلة أخرى. كما يمكنك أيضاً تجربة إضافة بعض المواد المضافة إلى الكاشف لاستكشاف المشكلات وإصلاحها. وبدلاً من ذلك، ضع في اعتبارك استخدام تقنية PCR ذات البدء الساخن (hot start PCR) كـتعديل متعدد الاستخدامات يتم فيه زيادة وقت المسخ الأولي بشكل كبير.

يُستخدم بعد ذلك الفصل الكهربائي لهلام agarose لفصل نواتج PCR لجين GAL3 المستخلص من الحمض النووي الجينومي لبكتيريا S seia، وذلك لتحديد التركيز الأمثل لأيونات المغنيسيوم لهذه المجموعة من الكواشف؛ يُلاحظ ظهور منتج PCR بالحجم المتوقع (2098 زوج قاعدي) بدءاً من تركيز مغنيسيوم 2.5 millimolar، مع وصول التركيز الأمثل إلى 4 millimolar. عند تضخيم قوالب DNA مختلفة، يتطلب ظهور منتج PCR المطلوب كنطاق منفصل تركيز 2 millimolar من المغنيسيوم. ويؤدي تقليل صرامة التفاعل إلى ظروف تضخيم دون المستوى الأمثل فعلياً إلى إنتاج لطخة من نواتج غير متخصصة.

علاوة على ذلك، ومع تقليل الصرامة العامة للتفاعل، تصبح هناك حاجة إلى كمية أقل من أيونات المغنيسيوم لتكوين أيقونة الأمبليكون. وبالتالي، فإن تحسين تفاعل PCR مع مراعاة المتغيرات يمكن أن ينتج المنتج المنشود بدقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد وتجهيز تفاعل البوليميراز المتسلسل.

الهدف هو فهم متغيرات كل تفاعل PCR وكيفية التحكم فيها لإنتاج قطعة التضخيم (amplicon) المطلوبة.