المكانية والزمانية التلاعب من نشاط GTPase الصغيرة على المستوى التحت خلوية وعلى المقياس الزمني من ثانية في الخلايا الحية

يوضح هذا الفيديو طريقة تُستخدم فيها الأشعة فوق البنفسجية للتحكم في نشاط بروتين عند الغشاء البلازمي. ولتحقيق ذلك، يتم إجراء ترنسفكشن مشترك للخلايا ببروتين FRB المثبت على الغشاء والبروتين المراد دراسته والمدمج مع FK BP. ثم يُضاف مشتق راباميسين محجوب ضوئياً إلى الوسط.

بعد ذلك، وأثناء التصوير الحي للخلايا، يتم تسليط الضوء فوق البنفسجي UV على منطقة محددة من الخلية. يتم شطر الرابط بين rapamycin وbiotin، مما يؤدي إلى تحرير المدمج الكيميائي وناتجه الثانوي؛ ثم ينتشر المدمج المتحرر داخل الخلايا ويحفز عملية الدمج بين البروتين المستهدف الموسوم بـ FKBP وبروتين FRB المثبت في الغشاء البلازمي في المنطقة التي تعرضت للإشعاع. وفي غياب الأشعة فوق البنفسجية UV، لا يرتبط FKBP بـ FRB، وبالتالي لا يحدث أي تأثير.

يكشف تحليل البيانات عن تجنيد موضعي للغاية للبروتين المدمج مع FKBP محل الدراسة بناءً على تأثيره الفسيولوجي. وتكمن ميزة هذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل النهج الفارماكولوجي والوراثي، في الجمع بين سرعة التأثير، والنوعية تجاه الهدف، والدقة المكانية. وتمتد تداعيات هذه التقنية نحو علاج نقائل السرطان التي تأتي نتيجة لهجرة الخلايا السرطانية.

لذلك، قد يكشف التلاعب بنشاط عوامل الهجرة الرئيسية عن آليتها الجزيئية الدقيقة، وهو أمر ضروري لعلاجها والشفاء منها. سيقوم بتوضيح الإجراء كريس بول ماير، وهو طالب دراسات عليا، وبوب دي روز، وهو فني من مختبري. ابدأ هذا البروتوكول بجمع ما يلي في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم: plasmid، وDNA، وmembrane tethered FRB، وFLUORESCENTLY tagged FKBP، وTIA one، وماء منزوع الأيونات، ثم أضف 1 µL من a few gene HD إلى الخليط وقم بالرج باستخدام جهاز vortex.

يُحضن الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. وأثناء فترة التحضين، يُضاف 50 µL من poly-L-lysine إلى كل بئر من آبار غرفة زجاجية ذات ثمانية آبار، ويُحضن لمدة دقيقة واحدة لطلاء السطح، ثم يُسحب المحلول ويُغسل مركز كل بئر بـ 50 µL من الماء منزوع الأيونات. بعد ذلك، يتم استخدام trypsin على خلايا NIH 3T3 بنسبة تلاقي تتراوح بين 80 إلى 85%.

بعد انفصال الخلايا، أضف 10 milliliters من DMEM الذي يحتوي على 10%FBS، ثم انقل 375 microliters من المعلق إلى أنبوب معقم سعة 15 milliliter وقم بالطرد المركزي عند 1,500 G لمدة ثلاث دقائق. بعد عملية الطرد المركزي، اسحب الوسط بعناية. أضف 750 microliters من DMEM مع 10%FVS وقم بإعادة التعليق.

قم بتعليق الراسب عن طريق السحب والطرد اللطيف باستخدام الماصة عدة مرات. وأخيراً، أضف معلق الخلايا إلى محلول عفن الخلايا (transfection solution)، واستخدم طرف الماصة للتحريك بلطف، ثم أضف 250 microliters من معلق عفن الخلايا إلى كل بئر من آبار الغرفة. قم بتمريرها وحضنها.

درجة حرارة 37 °C لمدة تتراوح من 15 إلى 18 ساعة. لتخليق راباميسين القفص، ومقترن البيوتين. ابدأ بتحضير محلول مخزون بتركيز 1 mM من CRB في DMSO في أنبوب طرد مركزي معقم، وفي أنبوب طرد مركزي دقيق منفصل سعة 1.5 mL، أذب 1 mg من avadon في 250 µL من PBS.

لربط شطر الحجب بـ rapamycin، أضف 0.5 µL من المحلول المخزون لـ CRB إلى AVID المذاب، ثم اخلطهما عن طريق القلب عدة مرات، وبعد ذلك يتم التحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وللحصول على محلول مرافق CRB AVID مع استبعاد الجزيئات الصغيرة غير المرتبطة وتنقية CRBA، قم بموازنة عمود استبعاد حجمي G 25 باستخدام 300 µL من PBS.

كرر العملية خمس مرات بعد وصول العمود إلى حالة التوازن. قم بتحميل 125 µL من محلول CRBA على السرير المركزي للعمود. بعد ذلك، قم بطرد المحلول مركزياً لمدة دقيقتين عند 800 G في درجة حرارة الغرفة، واجمع السائل النافذ في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL بعد إجراء عملية عفن الخلايا.

استبدل الوسط بوسط DMEM الخالي من FBS لإجاعة الخلايا من المصل ثم حضنها لمدة 12 ساعة. بعد فترة التحضين، اسحب الوسط برفق وأضف 250 µL من محلول CRBA المُحضّر بتركيز 1 µM. بعد ذلك، ولتصوير ديناميكيات البروتين في الخلايا الحية، استخدم مجهراً بؤرياً بقرص دوار (spinning disc confocal microscope) مزوداً بإضاءة UV، مع ربط البصريات بمصباح UV LED بطول موجي 365 nm.

باستخدام ضوء الفلورة فوق البؤرية (epi fluorescence). حدد إحداثيات وحجم بقعة الإضاءة باستخدام لوح زجاجي مطلي بصبغات فلورية يتم تحفيزها بواسطة الأشعة فوق البنفسجية UV. يتيح ذلك الضبط الدقيق للمنطقة المراد تعريضها للإشعاع.

ضع شريحة الغرفة التي تحتوي على الخلايا على المنصة باستخدام عدسة شيئية 100 x والفلورة فوق الناقلة (epi fluorescence). اضبط بؤرة الخلايا وحدد خلية واحدة. وبالنسبة للتصوير، ابدأ بتصوير الخلايا بعد تحديد مستويات الخلفية للتأثير الفسيولوجي.

هنا، يتم قياس تكشكش الغشاء عن طريق تسليط الأشعة فوق البنفسجية UV على ربع واحد مختار من الخلية، وإذابة rapamycin غير المقيد في DMSO ثم في PBS للوصول إلى تركيز نهائي قدره 400 nanomolar. يتم إضافة 100 µL من المحلول إلى غرفة التصوير لاستحثاث تأثيرات شاملة. يتم التقاط صور الفلورسنت كل 15 ثانية لمدة 20 دقيقة لتحديد ما إذا كان التنشيط الموضعي لـ RAC يمكن أن يؤدي إلى تكوين تكشكش موضعي.

تم ترانسفكشن خلايا NIH 3T3 ببروتين FKbp منشط لـ RAC موسوم بـ YFP، وTIA1 وLDR المرتبط بالغشاء. تبع ذلك تسليط إشعاع موضعي بـ FRB عند حافة الخلية، والمشار إليها بالدائرة الصفراء، ثم إضاءة شاملة باستخدام مصباح زئبقي لمدة ثانية واحدة بدءاً من الثانية 1063. وكما يتضح هنا، لم يكن هناك أي تكرمش غشائي تقريباً في البداية.

ومع ذلك، لوحظ حدوث تكشكش محصور مكانيًا بعد الإضاءة الموضعية، وذلك عقب الإضاءة الشاملة وإضافة rapamycin، الذي يتسبب في انتقال FK bp TIA one إلى الغشاء البلازمي. وقد أظهرت الخلية تكون تكشكش شامل، مما يشير إلى أن تكون التكشكش الموضعي الملاحظ سابقًا كان ناتجًا عن تنشيط محصور مكانيًا لـ rack. ولإجراء تحليل كمي، قُسمت الخلايا المستهدفة إلى أربعة أرباع، وتم تحديد تكرار تكون التكشكش في كل ربع عند التحفيز الموضعي وكذلك بعد التحفيز الشامل، كما هو موضح في هذا الرسم البياني.

لم تظهر أي من الخلايا المرصودة تشكّل الثنيات (ruffle formation) عند إضافة CRBA بدون تشعيع UV أو بتشعيع UV موضعي، أو بتشعيع UV مع أو بدون Aden في الوسط العام. ومع ذلك، عند إضافة CRBA وإجراء تشعيع UV، لوحظ تشكّل الثنيات بنسبة متقاربة بلغت حوالي 90% في جميع الأرباع مع التشعيع الشامل؛ بينما عند تشعيع الربع الأول فقط، بلغت نسبة تشكّل الثنيات 100% مقارنة بـ 30% و25% و30% في الأرباع من الثاني إلى الرابع. تشير هذه النتائج إلى أن إزالة القفص (uncaging) الموضعي للراباميسين يمكن استخدامه لتحفيز تأثيرات فسيولوجية موضعية للغاية داخل خلية واحدة.

في هذه الحالة، يحدث تكشكش الغشاء الناتج عن تنشيط rack. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحقيق التحكم المكاني والزماني لنشاط small g TPAs عن طريق الضوء. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي عملية فسيولوجية تعتمد على انتقال بروتينات معينة إلى الغشاء البلازمي.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تحضير المحاليل والكواشف والخلايا حديثاً لكل عملية. لا تنسَ أن العمل باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (UV) يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء نظارات الحماية من الأشعة فوق البنفسجية.