رصد انتقاصية ومؤكسد نصف ردود فعل من Monooxygenase فلافين التي تعتمد على استخدام توقف تدفق الطيفي

يستخدم هذا الإجراء جهاز التدفق الموقوف للكشف عن الأشكال الطيفية المختلفة لـ SID A وقياس المعدلات. يمكن تقسيم التفاعل الذي يحفزه SID A إلى تفاعلات نصفية اختزالية وأكسدية لـ FAD. يرتبط الفلافين المؤكسد بـ N-A-D-P-H ويتفاعل لتكوين الفلافين المختزل و NADP، بالإضافة إلى تفاعل الأكسجين الجزيئي وارتباط الأورنيثين الذي يؤدي إلى تكوين C four.

بعد هيدروكسلة الأورنيثين، يتم نزع الماء من الهيدروكسي فلافين لتكوين الإنزيم المؤكسد. يظل NA DP plus مرتبطاً طوال الدورة التحفيزية ويكون آخر مادة تفاعل يتم تحريرها. تسهل أداة التدفق المتوقف الخلط السريع لأحجام صغيرة من المواد المتفاعلة وتسجيل النتائج.

يتيح قياس التغيرات الطيفية بمرور الوقت باستخدام مقياس الطيف الضوئي قياس معدل تكوين واختفاء النواتج في التفاعل المحفز إنزيميًا، وتحديدًا للوسطاء العابرين. ستقوم ريتا روبنسون وإنفيرو روميرو، من مختبري، باستعراض هذه التجارب باستخدام المجموعة A مع إنزيم flavor mono oxygenase كنظام نموذجي. صُب 250 milliliters من محلول potassium phosphate buffer بتركيز 100 millimolar في دورق buchner بسعة 500 milliliters يحتوي على قضيب تحريك.

أغلق القارورة بسدادة مطاطية، ثم ضعها على لوح تحريك وقم بتوصيل الأنبوب القصير للقارورة بخط تفريغ شلينك (schlenk line). قم بإزالة الغازات من المحلول المنظم تحت تفريغ لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع التقليب، يليه الشطف بغاز argonne. كرر هذه العملية خمس مرات.

وأخيراً، قم بتطهير القارورة بغاز Argonne لمدة 10 ثوانٍ. افصل القارورة عن مجمع التفريغ وضعها داخل الصندوق القفازي. استمر في التقليب بقوة بينما القارورة مفتوحة.

املأ محاقن الخزان بمحاليل glucose oxidase بتركيز 18.13 وحدة لكل ملي لتر، ومحاليل جلوكوز بتركيز 100 millimolar. الآن، اضبط صمامات التشغيل على وضع التحميل. املأ محاقن التشغيل.

بعد ذلك، قم بتحويل الصمام F إلى وضع التشغيل. باستخدام برنامج التحكم في البيانات (pro data control software)، انقر فوق إفراغ محقنة الإيقاف، ثم ادفع المنظم من محقنة التشغيل F عبر دائرة التدفق عن طريق رفع مكبس التشغيل المقابل يدوياً. استمر في تنفيذ ذلك مع محاقن التشغيل الثلاث الأخرى، مع موازنة النظام لمدة ساعة واحدة.

الآن، أعد ملء محاقن الخزان وكرر عملية غسل نظام التدفق المتوقف. ولتحضير محلول منظم مشبع بالأكسجين، قم بدفع فقاعات من الأكسجين بنسبة 100% في المحلول لمدة ساعة واحدة مع التقليب.

بعد ذلك، قم بإزالة الإبرة القصيرة من القارورة وانتظر لمدة 10 ثوانٍ. تابع بإزالة الإبرة الطويلة ثم ضع القارورة المغلقة في صندوق القفازات. بالنسبة لمحلول N-A-D-P-H.

ضع أنبوب إينور سعة 1.5 milliliter يحتوي على 1 milligram من N-A-D-P-H داخل صندوق القفازات. أذب المادة في 300 µL من محلول potassium phosphate buffer لاهوائي بتركيز 100 millimolar وpH 7.5.

قم بسحب 30 µL لتقدير تركيز N-A-D-P-H. ولإزالة الأكسجين من المخزون الإنزيمي، انقل المحلول إلى قارورة سعة 25 mL تحتوي على قضيب تقليب وسدادة وإغلاق من الألومنيوم. ثم ضعها على الثلج.

قم بالتوصيل بخط شلينك (schlink line)، ثم قم بإزالة الغازات عن طريق التفريغ لمدة 20 دقيقة، يليه الغسل بغاز argonne. وأخيرًا، قم بغسل القارورة بغاز Argonne لمدة 10 ثوانٍ وافصلها عن مجمع التفريغ. ضع القارورة على الثلج داخل صندوق القفازات.

في نافذة لوحة التحكم الخاصة ببرنامج pro data control، حدد photo diode array و external trigger و logarithmic scale. قم أيضاً بتشغيل برنامج pro data viewer وتحديد الدليل الخاص بتخزين ملفات البيانات.

الآن استبدل المحلول في محاقن الخزان C و F بمحلول منظم من فوسفات البوتاسيوم بتركيز 100 millimolar لاهوائي وبقيمة pH 7.5. أدر الصمامات C و F إلى وضع التشغيل (drive). انقر فوق "تفريغ محقنة الإيقاف" (empty the stop syringe) في برنامج التحكم في بيانات البروتين (pro data control software).

بعد ذلك، ادفع المحلول المنظم من كلتا سرنجتي الدفع عبر دائرة التدفق عن طريق رفع مكبس الدفع المقابل يدويًا. كرر عملية الشطف باستخدام سرنجتي الخزان C و F ثلاث مرات إضافية. ولضمان الإزالة الكاملة لـ glucose oxidase من دائرة التدفق، انتقل إلى النقر على baseline في برنامج pro data control.

استبدل المحلول الموجود في محقنة الخزان F بمحلول الإنزيم. أدر الصمام F إلى وضع التشغيل (drive). انقر فوق "تفريغ محقنة الإيقاف" (empty the stop syringe) في برنامج التحكم في البيانات (pro data control software).

ادفع محلول الإنزيم من سرنجة الدفع F عبر دائرة التدفق عن طريق رفع مكبس الدفع المقابل يدويًا. ارجع إلى برنامج التحكم في البيانات (pro data control software) لضبط وقت الاستحواذ على 60 ثانية. تحقق من أن كلتا سرنجتي الدفع مملوءتان بالمحاليل المقابلة لهما وأن مكابس الدفع في حالة تلامس مع مكابس سرنجات الدفع.

أدر كلا الصمامين إلى وضع التشغيل (drive position)، وانقر على "acquire" في برنامج التحكم في البيانات (pro data control software) لبدء التشغيل. قم بجمع البيانات الطيفية للشكل المؤكسد من الإنزيم في ثلاث مكررات باستخدام قيمة A 452 nanometer التي تم الحصول عليها من عمليات التشغيل. حدد تركيز الإنزيم قبل الخلط وقم بتحضير 4 mL من محلول N-A-D-P-H.

املأ محقنة خزان التعبئة C بمحلول N-A-D-P-H بتركيز أعلى بمقدار 1.5 مرة، ثم قم بتفريغ وإعادة ملء محقنة الإيقاف ثلاث مرات كما هو موضح سابقاً. الآن، قم بالحصول على الأطياف أثناء اختزال الإنزيم، وقم بشطف المحتويات من دائرة التدفق باستخدام محلول منظم من فوسفات البوتاسيوم لاهوائي بتركيز 100 millimolar و pH 7.5. الآن، انقر فوق baseline في برنامج pro data control.

بعد ذلك، امزج 200 µL من المحلول المخزون للإنزيم مع 1000 µL من منظم فوسفات البوتاسيوم اللاهوائي بتركيز 100 mM ورقم هيدروجيني pH 7.5. استبدل المحلول الموجود في سرنجة الخزان A بمحلول الإنزيم.

قم بتحويل الصمام A إلى وضع التشغيل (drive) في برنامج التحكم في البيانات الاحترافية (pro data control software). انقر على "إيقاف تفريغ السرنجة" (stop syringe empty). ادفع محلول الإنزيم من سرنجة التشغيل A عبر دائرة التدفق عن طريق رفع مكبس التشغيل المقابل يدويًا.

اضبط وقت التأخير على 0.5 seconds ووقت الاستحواذ على 60 seconds. تحقق من أن جميع محاقن الدفع ممتلئة بالحلول المقابلة لها، وأن مكابس الدفع ملامسة لمكابس محاقن الدفع. بعد ذلك، أدر جميع صمامات الدفع إلى وضع الدفع، ثم انقر على acquire في برنامج pro data control.

احصل على البيانات الطيفية للشكل المؤكسد من الإنزيم في ثلاث مكررات. بعد ذلك، استبدل محلول حقنة الخزان B بمحلول N-A-D-P-H يكون تركيزه أعلى بمقدار 1.5 مرة من تركيز محلول الإنزيم في الحقنة A. أدر الصمام B إلى وضع التشغيل (drive) وقم بتفريغ وإعادة ملء حقنة الإيقاف ثلاث مرات كما هو موضح سابقاً في نافذة لوحة التحكم.

اضبط وقت التأخير على 0.5 ثانية. عند الوصول إلى الثانية 20 من عملية الاستحواذ، استبدل المحلول الموجود في محقنة الخزان بالمحلول المنظم المكسج. أدر الصمام C إلى وضع التشغيل.

قم بعملية الشطف ثلاث مرات باستخدام برنامج التحكم في البيانات Pro Data. اضبط وقت التأخير على 15 ثانية ووقت الاستحواذ على 900 ثانية. استمر في استحواذ الأطياف أثناء عملية إعادة أكسدة الإنزيم المختزل بالكامل في جهاز التدفق المتوقف (stopped flow).

يمكن مراقبة الاختزال اللاهوائي لـ SID A باستخدام N-A-D-P-H عن طريق قياس التغيرات في حالة الأكسدة والاختزال للفلافين باستخدام الامتصاص عند 452 نانومتر هنا. يتم تسجيل التغيرات الطيفية بمرور الوقت من SID A المؤكسد وصولاً إلى الطيف الأخير لـ SID A المختزل تماماً. ويمكن تحديد معدل هذه الخطوة الإنزيمية عن طريق مطابقة البيانات مع المعادلة المناسبة. كما يمكن تحديد معدل الأكسدة والوسائط التفاعلية باستخدام وضع الخلط المزدوج لجهاز التدفق المتوقف (stopped flow) في هذا التفاعل بواسطة AF Sid A. يتم الكشف بوضوح عن وسيط C four A Hydroxi flavin بطول موجي أقصى (lambda max) يبلغ 380 نانومتر، بينما يمتلك الإنزيم المؤكسد طولاً موجياً أقصى (lambda max) يبلغ 450 نانومتر.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون أربع إلى ست ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح. تذكر التأكد من أن المحاليل لاهوائية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استقصاء كل من الأيونات النسبية والتقرحية لـ FLA المستقلة أحادياً في التجارب اللاحقة مثل الكيمياء السريعة.

يمكن لـ Quentin أن يساعد في توضيح الطبيعة الحزينة للمركبات الوسطية.