تحليل الفاكهة المتطايرة باستخدام الأنف الالكتروني

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء تحليل سريع للمركبات المتطايرة في الفواكه. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق قطع أنسجة الفاكهة وتجانسها، ثم يتم تحليل طور البخار الموجود فوق العينة السائلة باستخدام الأنف الإلكتروني.

بعد تحليل الأنف الإلكتروني، يتم تصدير البيانات وتحويلها. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في تحديد نوافذ مؤشر covas ودمج القمم تحت تسمية مؤشر covas واحدة باستخدام الواجهة الرسومية. وفي الختام، تُظهر النتائج أن الاختلافات في وفرة بصيلات الفاكهة، كما تم قياسها بواسطة الأنف الإلكتروني، يمكن ربطها بالمعاملات التجريبية مثل صنف الفاكهة، ودرجة النضج، والتخزين.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الكروماتوغرافيا الغازية التقليدية، في أنها تتيح تحليلاً أسرع للمركبات المتطايرة في الفاكهة. وعند إجراء هذا التحليل، قد تحدث تغييرات طفيفة في أوقات استبقاء المواد المراد تحليلها، وهو ما قد يؤدي إلى تفسير خاطئ للبيانات دون دراسة دقيقة لعملية محاذاة القمم.

بعد حصاد الثمار في مرحلة النضج المطلوبة، اشطفها بماء الصنبور. اختر الثمار المخصصة للتحليل بناءً على خلوها من العيوب الخارجية والداخلية وتجانس أحجامها، وذلك لإزالة الأوساخ والغبار. اقطع الثمار طولياً إلى شرائح إسفينية لاستخدامها في أخذ عينات المواد المتطايرة.

عند الاقتضاء، قم بإزالة بذور القشرة، أو أنسجة تجويف البذور، أو نواة الثمرة. يجب أن يكون اختيار الأنسجة متسقاً طوال التجربة، كما يجب مراعاة التباين داخل الثمرة الواحدة. على سبيل المثال، يجب الحصول على العينات بالتساوي من أجزاء الطرف الزهري والطرف الساقي الاستوائية.

اجمع أنسجة الفاكهة المختارة، واخلطها لضمان العشوائية، ثم زن 200 grams وضعها في خلاط تجاري. أضف 200 milliliters من محلول كلوريد الكالسيوم المشبع. يهدف كلوريد الكالسيوم إلى العمل كمثبط للنشاط الإنزيمي الذي قد يحدث بعد تقطيع وتجانس لب الفاكهة.

ثم أضف 50 µL من محلول بتركيز 100 mM من two methyl butyl iso ate في الميثانول. يُضاف هذا المحلول كمعيار داخلي لمراقبة أي فقد محتمل للمركبات المتطايرة أثناء عملية التجانس. بعد ذلك، قم بتجانس الخليط في خلاط مختبري لمدة 30 ثانية بسرعة 18,000 RPM.

ثم اسكب المزيج فوراً في زجاجة زجاجية وأغلقها بغطاء من التفلون. احتفظ بالمعلق المتجانس في الزجاجة حتى يتم تحضير جميع العينات. وباستخدام الماصة، انقل حصصاً بمقدار 5 mL من العصير الخالي من الرغوة إلى قوارير زجاجية كهرمانية سعة 20 mL، مع تحضير ثلاث قوارير على الأقل لكل عينة.

لتعمل كمكررات تقنية. تُغلق القوارير بأغطية لولبية فولاذية مزودة بحواجز من السيليكون والتفلون. عند هذه النقطة، يمكن تحليل العينات فوراً أو تجميدها سريعاً في النيتروجين السائل وتخزينها في درجة حرارة منخفضة للغاية للتحليل لاحقاً.

قم بتحميل طريقة التحليل المناسبة على جهاز Xenos. أدخل المعاملات كما هي موضحة في البروتوكول المكتوب. قم بتوصيل إبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ ذات طرف غير ثاقب بمدخل جهاز xenos.

قم بتطهير النظام عدة مرات بالهواء المحيط حتى يستقر خط الأساس ولا يتم اكتشاف أي قمم تتجاوز 200 عدة. استعد لضبط الجهاز عن طريق إدخال إبرة في سدادة قنينة تحتوي على محلول من acas ذات سلسلة مستقيمة لتخفيف الضغط. ثم أدخل الإبرة المتصلة بمدخل الجهاز في السدادة.

قم بإجراء عملية الضبط من خلال بدء أخذ عينات الحيز الرأسي (headspace sampling). تُستخدم نتيجة الضبط بواسطة برنامج الجهاز لتحويل زمن الاستبقاء للقمم المشار إليها من وحدات زمنية إلى وحدات مؤشر covas أو وحدات KI. وبناءً على ذلك، بعد ضبط النظام، يتم تسجيل أزمنة الاستبقاء بوحدات KI.

ابدأ تحليل العينة بعد موازنتها لمدة 30 دقيقة عن طريق إدخال الإبر في السدادة المطاطية لقارورة العينة. كما تم القيام به في محلول acas ذات السلسلة المستقيمة. ابدأ أخذ عينات الحيز العلوي يدويًا بالنقر فوق زر التشغيل، مما يؤدي إلى تفعيل المضخة وسحب الأبخرة الموجودة فوق العينة.

في نهاية التحليل، يظهر مخطط كروماتوغرافي على الشاشة ويتم تسخين المستشعر تلقائياً إلى 150 °C لمدة 10 ثوانٍ لتنظيفه. وعندما يتحول مربع حالة النظام إلى اللون الأخضر مرة أخرى، يصبح الجهاز جاهزاً لتحليل عينة أخرى. ولضمان استقرار الخط القاعدي والتنظيف الصحيح للنظام، قم بتشغيل عينة فارغة من الهواء (air blank) واحدة على الأقل بين كل عينة وأخرى.

قم بتحليل ثلاث مكررات تقنية على الأقل لكل عينة، بالإضافة إلى عينات فارغة (vial blanks). قم بتصدير البيانات إلى ملف Microsoft Excel بعد عملية الاستحواذ باستخدام وظيفة بيانات السجل المخزنة (log stored data) في برنامج Mense. وبمجرد تصدير البيانات، أضف أعمدة تحتوي على تسميات للمتغيرات والمكررات.

يمكن تحويل تنسيق البيانات المُصدّر من برمجيات الجهاز لتسهيل معالجتها باستخدام نص برمجى (script) بلغة Python 0.6 تم إنتاجه بواسطة هذا المختبر. يتم تعديل اسم الملف المصدر واسم الورقة لبيانات الإدخال، بالإضافة إلى اسم الملف المطلوب للمخرجات مباشرةً في النص البرمجي. يسهل هذا النص البرمجي معالجة البيانات وتحليلها من خلال تحديد قيم ki الفريدة عبر جميع العينات.

يتم إعادة ترتيب البيانات بحيث تظهر معلومات العينات في الصفوف ومؤشرات KIS الفريدة في الأعمدة، حيث تمثل كل خلية مساحة القمة المقابلة. وفي حال عدم اكتشاف قمة لقيمة KI معينة في عينة ما، تظل الخلية المقابلة فارغة. بعد ذلك، وباستخدام نص برمجي ثانٍ تم إنشاؤه بواسطة عملية استيراد المختبر هذه، يتم استخراج البيانات من الملف الذي تم تحريره في الخطوة السابقة.

يعتمد التحليل على معاينة وتحليل عدد مرات اكتشاف كل قيمة KI. وبناءً على ذلك، يعرض البرنامج رسمًا بيانيًا شريطيًا لضربات KI. بالنسبة لكل قيمة KI، يتم تقييم ضربات K لمجموعات فرعية محددة من العينات، مع تحليل كل مجموعة من المكررات التقنية معًا.

للقيام بذلك، قم بتحليل كل معاملة أو متغير على حدة عن طريق تحديد أو إلغاء تحديد المربعات المقابلة. بعد تحديد عرض كل نافذة KI باستخدام الواجهة الرسومية، اختر عشوائياً بعض الكروماتوغرامات المقابلة. قم بتقييم القمم المتداخلة بين المكررات التقنية في برنامج mense.

بمجرد تحديد نافذة KI، تُستخدم ميزة الدمج في الواجهة الرسومية لدمج KIS التي تقع ضمن النافذة في الـ ki الأكثر كثافة أولاً. انقر فوق زر الدمج لتنشيط هذه الميزة، ثم حدد الـ ki الأكثر كثافة في مركز النافذة عن طريق النقر بزر الماوس الأيسر على الشريط المقابل. وبمجرد تحديد الشريط، سيتغير لونه إلى الأخضر؛ لدمج KIS التي تقع ضمن النافذة في الـ ki المحددة، انقر بزر الماوس الأيمن على الأشرطة المقابلة.

يؤدي هذا إلى تحول الأشرطة إلى اللون الأحمر، بينما يُضاف شريط أزرق بالطول المقابل فوق الـ ki المركزي. وبمجرد دمج جميع الـ kis المختارة في الـ ki المركزي المناسب، انقر على زر الدمج مرة أخرى لقبول التغييرات. ويؤدي هذا إلى تحول زر الدمج إلى اللون الأصفر في حالة حدوث أخطاء.

يتوفر أيضاً زر إلغاء الدمج للقيام بعملية إلغاء الدمج. انقر فوق زر إلغاء الدمج في الواجهة الرسومية، ثم انقر بزر الفأرة الأيمن على الشريط الأحمر المراد إلغاء دمجه.

يتحول لون الشريط من الأحمر إلى الأزرق. انقر فوق زر إلغاء الدمج مرة أخرى لقبول التغييرات. وفي حال محاولة دمج قمتين في عينة واحدة بشكل غير صحيح في قيمة KI واحدة، ستظهر رسالة خطأ.

بمجرد حفظ ملف جميع عمليات الدمج قبل البدء في التحليل الإحصائي، يتم تحليل الكروماتوغرامات الخاصة بفراغات الهواء والقوارير لمراقبة التلوثات المحتملة. وبمجرد تحديد ki للقمم والفراغات، اطرح مساحة القمة المكتشفة في فراغ الهواء و/أو فراغ القارورة من مساحة القمة الموجودة. في العينة، تمكن الأنف الإلكتروني من اكتشاف الاختلافات في ملامح المواد المتطايرة بين ثمار الشمام التي تم حصادها في مراحل نضج مختلفة.

تظهر هنا أمثلة على الكروماتوجرامات من ثمار في مرحلة النضج المبكر وثمار ناضجة تماماً، مما يكشف عن الاختلافات في مساحة القمة. بالنسبة للعديد من القمم، تم تحديد نوافذ بحجم 20 K عبر جميع العينات. وأظهر تحليل التباين أن وفرة 14 قمة تم اكتشافها بواسطة الأنف الإلكتروني من بين هذه النوافذ المختلفة قد تباينت بشكل ملحوظ بين مرحلتي النضج. هنا، تم رسم وفرة القمة للثمار في مرحلة النضج المبكر لكل من هذه النوافذ باللون الأخضر، بينما رُسمت وفرة الثمار الناضجة تماماً باللون البرتقالي.

بعد إتمام هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل كروماتوغرافيا الغاز المقترنة بطيف الكتلة من أجل تحديد المكونات المقابلة للقمم الفردية في الأنف الإلكتروني بعد تطويره. ستوفر هذه التقنية أداة تحليل سريعة وتسمح للباحثين في مجالات أمراض النبات، ووظائف أعضاء النبات، وبيولوجيا ما بعد الحصاد، وعلوم الأغذية باستكشاف التغيرات في تكوين المركبات المتطايرة في الفاكهة كدالة للنضج، أو الصنف، أو التخزين. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل المركبات المتطايرة بسرعة باستخدام الأنف الإلكتروني وإجراء محاذاة القمم باستخدام واجهتنا الرسومية.