ميكروفلويديك الخلاطات لدراسة طي البروتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو خلط محلولين بسرعة لبدء تفاعل كيميائي حيوي على مقياس الميكروثانية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تصنيع خلاط مائعي دقيق. وتتمثل الخطوة الثانية في ربط الشريحة بزجاج غطاء لإغلاق القنوات.

بعد ذلك، يتم تركيب الشريحة على مجمع يحتوي على خزانات المحلول. وتتمثل الخطوة النهائية في تصوير المحلول المخلوط باستخدام مجهر الفلورة البؤري. وفي النهاية، يتم رصد التفاعل الكيميائي الحيوي على مقياس الميكروثانية عن طريق تحويل المسافة على طول قناة الخروج إلى زمن.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل خلط التدفق المتوقف (stop flow mixing)، في أن عملية الخلط لا تتقيد بالاضطرابات وتحدث في غضون بضع ميكروثوانٍ. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة عن أسئلة جوهرية في مجال طي البروتين، مثل متى يحدث الانهيار الكاره للماء؟ سيقوم لينغ وو، وهو باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري، بشرح الإجراء لبدء تصنيع رقائق الخلط الموائعية الدقيقة.

أولاً، قم بتنظيف رقاقات السيليكا FU قياس أربع بوصات باستخدام محلول بيرانا طازج كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المصاحب لهذا الفيديو. بعد ذلك، استخدم فرن ترسيب البخار الكيميائي ذو الضغط المنخفض لوضع طبقة من البولي سيليكون بسمك ميكرون واحد تقريباً لكل 10 ميكرون من العمق المستهدف للقنوات الموائعية الدقيقة النهائية. وبعد إجراء المزيد من المعالجات للرقاقات كما هو موضح في النص، قم بطلاء الرقاقات باستخدام تقنية الطلاء الدوراني بطبقة سمكها 900 نانومتر من المادة المقاومة للضوء Z 52 14، ثم قم بإجراء الخبز اللين عند درجة حرارة 90 °C مباشرة على لوح تسخين لمدة دقيقة واحدة أو في فرن عند درجة حرارة 110 °C لمدة 30 دقيقة.

بعد محاذاة القناع الضوئي، قم بإجراء تلامس صلب وتفريغ هوائي عن طريق تعريض المقاوم الضوئي للأشعة فوق البنفسجية (UV) لعدة ثوانٍ أولاً. ثم قم بتحميض النمط في المقاوم الضوئي كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. افحص السمات الموجودة على الرقاقة باستخدام المجهر، ثم قم بعملية الخبز الصلب عند 115 درجة Celsius مباشرة على لوح تسخين لمدة دقيقتين.

بعد ذلك، قم بإزالة الملوثات العضوية (DCU) من الرقاقات باستخدام جهاز Asher أو بلازما الأكسجين لمدة 2.5 دقيقة وبقدرة تردد راديوي (RF) تبلغ 100 وات. وباستخدام جهاز الحفر الأيوني التفاعلي العميق، قم بحفر طبقة السيليكا المتعددة بالكامل وصولاً إلى السيليكا المنصهرة الموجودة أدناه. قم بإزالة ما تبقى من المادة المقاومة للضوء وعالج الرقاقة وفقاً للإرشادات الواردة في النص.

قم بقياس عمق النقش للتأكد من اختراقه بالكامل لطلاء البولي. باستخدام جهاز نقش أيوني تفاعلي عميق قادر على نقش الأكسيد، قم بنقش السيليكا المدمجة إلى عمق يصل إلى 10 ميكرون تقريبًا لكل ميكرون من سماكة طلاء البولي. نظف الرقاقة باستخدام جهاز Asher مصفوفي لمدة أربع دقائق، وبقدرة تردد لاسلكي RF تبلغ 100 وات، ثم قم بإزالة البولي سيليكون باستخدام جهاز نقش ثنائي فلوريد الزينون. قبل حفر الثقوب في الرقاقة، قم بطلاء طبقة جديدة من مادة مقاومة الضوء بسماكة ميكرون واحد عن طريق الطلاء الدوراني لحماية القنوات أثناء عمليات المناولة اللاحقة.

ثم قم بتثبيت الرقاقة بحيث يكون الجانب الذي يحتوي على الميزات متجهًا لأسفل على لوح زجاجي تضحوي باستخدام Aqua Bond 55. مع الحرص على إبقاء مادة الربط خالية من الفقاعات، استخدم مثقابًا ذا رأس ماسي يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر ومبرد مع محلول تنظيف micro 90. وهذا يمنع التصاق قطع الزجاج الصغيرة بالقنوات، والتي قد تؤدي لاحقًا إلى انسداد الشريحة أثناء الاستخدام.

باشر بحفر ثقوب الدخول والخروج في كل شريحة. اشطف الرقاقة بالماء منزوع الأيونات باستخدام حقنة لحقن الماء في كل ثقب. ثم انقعها في ماء صابوني لمدة ساعة واحدة بعد إزالة الطبقة الحساسة للضوء.

ضع المقاوم (Resist) والمادة الرابطة (bonder) كما هو موضح في النص. اشطف الرقاقة بالماء منزوع الأيونات والماء الدافئ والصابون. اشطف كل ثقب مرة أخرى باستخدام سرنجة، مع تجنب الميزات المحفورة بعد تمرير النيتروجين فوق الرقاقة.

استمر في التجفيف في فرن تفريغ مضبوط على 120 °C. افحص الثقوب للتأكد من خلوها من الشوائب، وكرر خطوات التنظيف حسب الضرورة. يجب تنفيذ الخطوات التالية في الغرفة النظيفة.

قِس عُمق القنوات باستخدام مقياس تضاريس السطح البصري أو الميكانيكي. نظّف الرقاقة بالإضافة إلى زجاج غطاء من السيليكا المصهورة كما هو موضح في النص داخل غرفة نظيفة. جفّف الرقاقة جيداً باستخدام غاز النيتروجين لمدة خمس دقائق على الأقل.

بعد ذلك، ضع الرقاقة بحيث يكون الجانب الذي يحتوي على الميزات للأعلى فوق كومة من ثلاث إلى أربع من مناديل الغرفة النظيفة الموضوعة على سطح صلب ومسطح مثل لوح زجاجي صغير. كرر العملية مع غطاء الزجاج. ارفع غطاء الزجاج من الحافة واقلبه بحيث يكون الجانب المصقول موجهاً للأسفل فوق الرقاقة.

قم بمحاذاة الحواف المسطحة بعناية، ثم ضع غطاء الشريحة الزجاجي فوق الرقاقة واتركه يستقر، مع تحريكه أفقياً فقط لضبط المحاذاة. اضغط بإصبع واحد على مركز الرقاقة، حيث ينبغي ملاحظة بدء انتشار جبهة الترابط نحو الخارج.

إذا لزم الأمر، قم بتطبيق ضغط إضافي على مواضع أخرى حول الرقاقة لدفع جبهة الترابط. وبعد وضع الرقاقات المختومة في فرن عالي الحرارة مبرمج وفق ملف تعريف درجة الحرارة المدرج في النص، قم بتقطيع الرقاقة باستخدام منشار تقطيع الرقاقات إلى شرائح فردية. يمكن صنع المجمّع الذي يحمل شريحة الخلط والمحاليل من البلاستيك مثل ليكسان أو البليكسي جلاس، أو من الألومنيوم.

للتحكم في درجة الحرارة، يتم تثبيت الشريحة بالمنشعب باستخدام حلقات دائرية (o-rings) صغيرة، وتثبيتها في مكانها بواسطة حلقة تثبيت تسمح برؤية بصرية واضحة لمركز الشريحة. يجب أن تكون أخاديد الحلقة الدائرية أقل عمقاً من المعتاد لضمان التوافق الجيد دون تسليط ضغط مفرط على الشريحة. وبمجرد تركيب الشريحة، تُضاف المحاليل إلى الخزانات المركزية والجانبية، مع الحرص على تحرير أي فقاعات محتبسة في قاع الآبار.

ضع المجمع على مجهر مقلوب وافحص منطقة الخلط باستخدام العدسة العينية أو مخرج الكاميرا. سيوفر مصباح يدوي متوهج يوضع فوق المجمع إضاءة كافية. استخدم صبغة أو محلولاً ذا معامل انكسار عالٍ في القناة المركزية لرؤية النفث.

بسبب صغر الأحجام المستخدمة في هذا المازج، يمكن التحكم في التدفق عن طريق تسليط ضغط هواء فوق آبار المحلول. ولرؤية النفاث، ابدأ بضبط ضغط القناة الجانبية عند صفر pounds per square inch ثم زده ببطء حتى يتساوى الضغط مع القناة المركزية. وإذا كانت إحدى القنوات الجانبية مسدوداً، فسيتم دفع النفاث باتجاه أحد جدران قناة المخرج.

في حالة ظهور انسداد مرئي، يمكن إزالته عن طريق تسليط ضغط أو تفريغ على قناة المخرج باستخدام حقنة. وإذا تسبب البروتين أو أي مواد عضوية أخرى في انسداد الشريحة، فيمكن تنظيفها عن طريق نقعها في محلول piranha طوال الليل. قم بتوجيه شعاع ليزر مغلف إلى مجهر من درجة بحثية باستخدام مرآة ثنائية اللون إما داخل المجهر أو خارجه مباشرة.

قم بمحاذاة الليزر بحيث تظهر نقطة التركيز في العدسة العينية أو الكاميرا بالقرب من منطقة الخلط إلى حد ما. يتم تجميع الفلورة المنبعثة من البروتين في الخلاط بواسطة العدسة الشيئية وإرسالها عبر المرآة ثنائية اللون، ثم يتم تركيزها بواسطة عدسة إلى ثقب صغير (pinhole) وتصويرها على عداد فوتونات. قم بمسح الشريحة باستخدام ماسح كهربائي ضغطي (piezo electric scanner) في المحورين x و y لتصوير منطقة الخلط.

اختر موقعاً على النفث وقم بالمسح في الاتجاهين X و Y للعثور على البؤرة في مركز القناة رأسياً. إن عمق المجال للمجهر أقل بكثير من عمق القناة، ومعدل التدفق منتظم في القناة باستثناء المنطقة التي تبعد ميكرون واحد عن الجدران. بناءً على ذلك، يتم تحديد الدقة الزمنية للفلورة المرصودة بشكل أساسي من خلال حجم البقعة البؤرية المشتركة.

قم بإجراء مسح أفقي داخل قناة الخروج بزيادات قدرها 100 micron على طول النفث، مع المراقبة لمدة مللي ثانية واحدة تقريباً لكل موضع. حرك منصة المجهر بمقدار 80 إلى 90 microns على طول النفث لالتقاط الأزمنة اللاحقة. بدلاً من ذلك، يمكن الكشف عن الضوء بواسطة مطياف وجهاز CCD بعد المرآة ثنائية اللون باستخدام عدسة لتركيز الضوء على شق المدخل.

بما أن عملية جمع البيانات أبطأ مقارنةً بعداد الفوتونات، فعادةً ما يتم تصوير النفاث أولاً باستخدام عداد الفوتونات، ثم تُقاس النقاط على طول النفاث باستخدام المطياف. يتم تحليل البيانات الواردة من عداد الفوتونات عن طريق جمع ثلاثة إلى خمسة بكسلات حول النفاث عند كل موضع لإنشاء مخطط يوضح الشدة مقابل المسافة. ويتم حساب الزمن من المسافة باستخدام سرعة محسوبة بناءً على الضغوط المطبقة.

كخطوة نهائية، قم بتحليل البيانات الناتجة عن المقياس الطيفي باستخدام إحدى الطرق الموصوفة في النص. يظهر هنا مخطط كونتوري لشدة الإشعاع في منطقة الخلط التي تم قياسها بواسطة عداد الفوتونات. يجب أن تكون الخلفية في قناة الخروج خارج النفاث قريبة من مستوى ضوضاء الكاشف، وعادةً لا يتم طرحها.

قد تشير الخلفية المرتفعة إلى ضعف المحاذاة أو التصاق البروتين بجدران القناة. وعلى العكس من ذلك، فإن النفاث الذي يبدو ملتوياً أو مائلاً، خاصة بالقرب من منطقة الخلط، يشير إلى ضعف في عملية حفر الفوهات. يظهر طيف محدد زمنياً لبروتين ACell coenzyme a binding protein أو A CBP الموسوم بـ Alexa 4 88 و Alexa 6 47.

توضح المستطيلات الخضراء والحمراء الأطوال الموجية المحددة كقنوات للمانح والمستقبل على التوالي. وقد تم طرح الخلفية من هذه البيانات لإزالة الشحنة المظلمة وإشارة الليزر. وقد تم أخذ إشارة الخلفية بضغط قناة مركزي يبلغ 0 pounds per square inch.

يمكن قياس وقت الخلط عن طريق قياس تفاعل سريع يكون أسرع بكثير من عملية الخلط، مثل إخماد فلورية التريبتوفان بواسطة يوديد البوتاسيوم. وبما أن النفّاث أصغر من الدقة البصرية للمجهر، يحدث انخفاض كبير في الشدة في منطقة الخلط. وعندما يتشكل النفّاث، يمكن إزالة استجابة الجهاز هذه عن طريق إجراء قياس ضابط لا تتغير فيه ظروف المحلول.

يوضح هذا الشكل النسبة بين تجارب الخلط وعدم الخلط لفلورة N-Acetyl tryptophan amide. يمثل الخط التركيز المتوقع ليوديد البوتاسيوم بناءً على النمذجة والمحاكاة باستخدام برنامج console multiphysics. ويبلغ زمن الخلط، مقاساً بالوقت اللازم لانخفاض التركيز بنسبة 80%، ثماني ميكروثانية.

يوضح هذا المخطط تغيرات قيمة FRET في بروتين A CBP بعد تخفيف المادة الممسخة من 6 molar إلى 0.06 molar. لا تتطلب هذه البيانات تجربة ضابطة. وبما أن قيمة FRET هي في الأصل نسبة مئوية وتم استبعاد استجابة الجهاز بالفعل، فإن القفزة السريعة بالقرب من T = 0 تمثل تغيراً سريعاً في إشارة FRET خلال زمن الخلط.

بعد هذا التطوير، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال طي البروتين لاستكشاف الخطوات الأولى في تكوين بنية البروتين.