RNA تسلسل تحليل التفاضلية التعبير الجيني في Electroporated الفرخ الجنينية الحبل الشوكي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم مستويات التعبير لجميع الجينات والعينات من الحبل الشوكي الجنيني للكتكوت الكهربائي. يتم تحقيق ذلك عن طريق أولا في البيض ، وحفر الجانب الأيمن من الأنابيب العصبية الجنينية المبكرة وإعادة احتضان الأجنة إلى المرحلة المرغوبة. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تشريح أنصاف الأنبوب العصبي المنقولة بنجاح في بيئة خالية من الحمض النووي الريبي والمضي قدما في التحلل في أسرع وقت ممكن.

الخطوة الثالثة هي عزل الحمض النووي الريبي وإخضاع العينات لإعداد المكتبة وتسلسل عالي الإنتاجية. الخطوة الأخيرة هي معالجة مجموعات البيانات لإزالة البيانات الاصطناعية للتسلسل. قم بتعيين السلالات إلى الجينوم وتعيين مستويات التعبير لكل جين.

في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج جينات معبر عنها تفاضليا من خلال مقارنة مستويات التعبير في ظروف التحكم والتجربة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية كتشريح للأنبوب العصبي. يصعب تعلم الخطوات لأننا نحتاج إلى الإلمام بالتلاعب بالأجنة.

في هذا العرض التوضيحي ، تم تحويل الأجنة باستخدام GFP الذي يعبر عن البناء في الأنبوب العصبي. استعد لقضاء ساعتين في العمل على ما يصل إلى 10 أجنة لجمع ميكروغرام إلى ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي لكل جنين. في ظل الحمض النووي الريبي ، والظروف الحرة ، حصاد الأجنة باستخدام مقص تشريح ناعم وملعقة تجميع SVE لنقل كل جنين إلى البرد.

عولج DEPC. استخدم PBS حلا لجميع خطوات عزل الأنبوب العصبي باستخدام ملاقط دقيقة لإزالة منطقة الجناح بأكملها للجنين بين براعم الأطراف. انقل هذا القسم إلى محلول بارد طازج مع وضع الجانب الظهري للأنسجة لأعلى.

استخدم إبرتين زجاجيتين رفيعتين لثقب ثلاث بقع على كل جانب جانبي ظهري من الجنين بين الأنبوب العصبي والأديم المتوسط الجانبي. أدخل الآن الإبرتين الزجاجيتين في الثقب المركزي وحركهما بعيدا عن بعضهما البعض على طول محور AP. افعل ذلك من خلال كل ثقب حسب الحاجة لفصل الأديم المتوسط البارالي في النهاية ، وإزالة هذا النسيج والتخلص منه.

بعد ذلك ، اقلب الجنين جانبا وأدخل أطراف ملاقطين بين الأنبوب العصبي والحبل العقدي. حركها بعيدا على طول محور AP لتقسيم الهياكل. قم بإنهاء إزالة القطع الكبيرة من الأنسجة الوسيطة من الأنبوب العصبي عن طريق تثبيتها برفق بالملاقط أثناء إزالة الأديم المتوسط الزائد.

ثم انقل الأنبوب العصبي برفق إلى محلول بارد طازج. باستخدام ماصة زجاجية مزودة بمضخة يدوية ، اجمع كل الأنابيب العصبية المطلوبة واحتفظ بها على الجليد قبل المتابعة. الآن ، قسم كل أنبوب من الأنابيب العصبية إلى نصفين.

أدخل ملاقط ذات طرف حاد في التجويف وقم بتمزيق لوحة السقف. ثم استخدم الملقط لقطع صفيحة الأرضية وتقسيم الأنسجة إلى نصفين. باستخدام مجهر تشريح الفلورسنت ، قم بفرز الأنبوب الكهربائي من النصفين غير الكهربائيين.

انقل أنصاف الأنبوب العصبي المصنف إلى أنبوب سعة 1.5 مل بمحلول جديد. انقر فوق هذه الأنابيب لتوصيل كل الأنسجة إلى الأسفل. بعد ذلك ، قم بتدوير الأنابيب عند 100 GS لبضع ثوان.

ثم بعناية فائقة تحت الإضاءة الساطعة ، استنشق snat. إذا تم سحب الأنسجة ، فقم بإخراجها ببطء وكرر الدوران. بمجرد إزالة نصفي الأنبوب العصبي من المحلول ، أضف 70 ميكرولترا لكل أنبوب عصبي ، ونصف المخزن المؤقت للتحلل إلى الأنبوب.

بتحريك الأنبوب واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة كل خمس دقائق ، وقم بتدوير الأنبوب بقوة واستمر في جمع الحمض النووي الريبي لتنقية الحمض النووي الريبي للتسلسل ، احصل على ثمانية أنصاف أنبوب عصبي على الأقل لكل عينة. يمكن تجميع مجموعات أخرى من الأنابيب العصبية المخزنة عند سالب 80 درجة مئوية في المجموعة. ابدأ بإذابتها على الجليد لمدة 15 إلى 30 دقيقة ، ثم أكمل الذوبان في درجة حرارة الغرفة.

بمجرد إذابة الجليد ، قم بدوامة جميع العينات بقوة واتركها لمدة خمس دقائق. ثم قم بتدوير العينات مرة أخرى وقم بطردها عند 15 ، 000 GS لمدة دقيقة واحدة. للتخلص من المواد غير القابلة للذوبان ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد واستمر في الاستخراج.

باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الريبي ، أكمل العملية عن طريق التهرب من الحمض النووي الريبي بأكبر تركيز ممكن. يتطلب هذا البروتوكول حساب موقع Galaxy على الويب لضمان حصة المساحة المطلوبة. أولا ، يقوم FTP بتحميل ملفات FASTQ إلى الموقع ما لم تكن درجات الجودة مشفرة بالفعل في Shred plus 33.

أولا ، قم بإعداد مجموعات البيانات التي تم تحميلها باستخدام أداة FASTQ groomer ضمن قائمة NGS QC و Manipulation. وإلا، ضمن السمات، قم بتغيير نوع الملف إلى مرسل FASTQ. بعد ذلك ، ضمن قائمة NGS QC و Manipulation ، استخدم أداة FAST QC لتحليل الجودة العامة لمجموعات البيانات.

حدد أداة تشذيب الجودة FASTQ ضمن نفس القائمة للتخلص من الأطراف الرئيسية الثلاثة ذات الجودة المنخفضة. يجب معالجة درجة الجودة 20 أو أعلى. انتقل الآن إلى أداة القصاصة ضمن نفس القائمة.

قم بتعيين هذه الأداة لتجاهل القراءات التي تحتوي على أقل من 45 زوجا أساسيا. أدخل تسلسل المحول. قم بتعطيل خيار تجاهل القراءات ذات القواعد غير المعروفة، واختر الإخراج لتضمين التسلسلات المقطوعة وغير المقطوعة.

تابع باستخدام أداة تسلسلات القطع. استخدمه لقص القواعد الأولى للقراءة لإزالة انحياز التسلسل الأساسي الخمسة الذي تم اكتشافه بواسطة FAST qc. الخطوة التالية هي تنزيل أحدث مجموعة جينوم الدجاج وفكها من موقع جينوم Illumina I.

ثم قم بتحميل ملف تنسيق الجينوم بالكامل بشكل أسرع وملف تنسيق GTF للتعليق التوضيحي للجين إلى Galaxy History. الآن قم بتعيين القراءات لكل عينة إلى الجينوم من خلال الوصول إلى قائمة تحليل N-G-S-R-N-A وتحديد أداة القبعة العلوية. حدد ملف fasta الذي تم تحميله من تاريخ Galaxy كجينوم مرجعي.

بعد ذلك ، اختر أداة روابط الأكمام ضمن نفس القائمة لإنشاء نسخة متوقعة. لكل عينة، اختر ملف GTF لاستخدامه كدليل مرجعي للتعليقات التوضيحية. حدد إجراء تصحيح التحيز باستخدام ملف FASTA لبيانات التسلسل وقم بتمكين خيار استخدام تصحيح القراءة المتعددة.

ثم ادمج جميع نسخ التجميع باستخدام أداة دمج الكفة. باستخدام هذه الأداة ، اختر ملف GTF للتعليق التوضيحي المرجعي وملف FASTA لبيانات التسلسل. قارن الآن ملفات BAM التي تم إنشاؤها بواسطة أعلى قبعة اثنين لكل عينة باستخدام أداة الكفة TIFF التي لا تزال ضمن قائمة تحليل الحمض النووي الريبي.

في حقل النصوص ، حدد نسخ الدمج الذي تم إنشاؤه بواسطة دمج الكفة وقم بتمكين الخيارات. استخدم القراءة المتعددة بشكل صحيح وقم بتصحيح التحيز باستخدام ملف FASTA لبيانات التسلسل. الخطوة التالية هي فرز الجداول التفاضلية باستخدام عمود قيمة Q ، حدد أداة الفرز من قائمة التصفية والفرز.

سيكون للتسلسلات ذات الاختلاف المعتد به بين الظروف التجريبية أدنى قيم Q في العمود 13. الآن ألق نظرة على الرسوم البيانية للتغطية. أولا ، قم بتحويل ملفات BAM إلى ملفات رسم بياني للسرير باستخدام أداة التحويل ضمن قائمة أدوات السرير ضمن الخيارات ، وقم بتعطيل الإبلاغ عن المناطق التي لا تحتوي على تغطية واختر التعامل مع الإدخالات المقسمة على أنها فترات زمنية مميزة.

قم أيضا بتوسيع نطاق التغطية بعامل يعمل على تطبيع جميع التغطيات في التجربة. ثم قم بتحويل ملف الرسم البياني للسرير الناتج إلى تنسيق شعر مستعار كبير باستخدام الأداة الموجودة في قائمة تنسيقات التحويل وقم بتحميل ملف شعر مستعار كبير كمسار مخصص إلى خادم UCSE. في صفحة متصفح الجينوم USCS ، استخدم GAL أربعة تجميع وعمليات بحث جينية للتغطية المرئية لمجموعات البيانات باستخدام الطرق الموصوفة التي تم حصاد الأنابيب العصبية التي تعبر عن نواقل PS الفارغة من أجل الحمض النووي الريبي الخاص بها.

تم ذلك في نسختين وكان الحمض النووي الريبي الناتج بجودة عالية جدا مع قيمة RIN مثالية تبلغ 10 كما هو متوقع. أظهرت المقارنة العالمية لنسخ عناصر التحكم في المتجهات الفارغة المكررة عدم وجود فرق واضح وكان معامل ارتباط بيرسون هو النقطة 99. أيضا ، كانت هناك زيادة واضحة في عدد القراءات المعينة لتسلسل الجينات في عينة تجريبية تعبر عن منطقة إصبع الزنك للخدش.

وبالتالي ، كانت الطرق حساسة بما يكفي للكشف عن التخصيب المتوقع. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قادرا على عزل الأنبوب العصبي الجنيني والحصول على فهم جيد لكيفية معالجة ومقارنة مجموعة بيانات IC للعثور على الجينات المعبر عنها تفاضليا باتباع خطوات تحليل السيليكون في القسم الرابع من البروتوكول.