تحليل الرئوي نضوج خلية شجيري والهجرة خلال التهاب الشعب الهوائية التحسسي

الهدف من هذا الإجراء هو تقييم نضج وهجرة الخلايا التغصنية الرئوية أو DC أثناء مسار التهاب الممرات الهوائية التحسسي الناجم عن Val Boomin في الفئران. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحسيس الفئران بـ Val Boomin، يليه تحفيز الممرات الهوائية باستخدام Val Boomin المسمى بـ fitsy. بعد ذلك، يتم استئصال الرئة والعقد الليمفاوية المنصفية.

أخيراً، يتم تحضير معلق خلوي أحادي من أنسجة الرئة والعقد اللمفاوية. وفي النهاية، يمكن تقييم حالة النضج والعدد المطلق للخلايا التغصنية في العقد اللمفاوية المنصفية بعد تحدي FITC Val Boomin عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية حول الاستجابات المناعية الرئوية، مثل ما إذا كانت الخلايا التغصنية تخضع للنضج عند التعرض للمستضد، وما إذا كانت تهاجر إلى العقد اللمفاوية المجاورة.

وإذا حدث الهجرة، فما هو معدل هذه الهجرة. ابدأ بإضافة محلول Val Boomin المُحضّر حديثاً قطرة تلو الأخرى بنسبة واحد إلى واحد في أنبوب من alum مع استخدام جهاز الرج (vortexing). حرّك الخليط لمدة 30 دقيقة، ثم املأ محقنة سعة 1 milliliter بـ 0.2 milliliters من الخليط.

باستخدام الإبهام والسبابة في إحدى اليدين، أمسك الفأر المراد حقنه من منطقة الرقبة بالقرب من قاعدة الجمجمة. بعد ذلك، احقن محلول Val Boomin alum في التجويف البريتوني للفأر باستخدام اليد الأخرى. وبعد سبعة أيام من الحقنة الثانية من Val in alum، أمسك الحيوان المخدر والمحسس بـ val in alum في وضع عمودي، ثم باستخدام رؤوس ماصات معقمة، ضع 100 µL من محلول val in fxi المحضر حديثاً على NAS الفأر على شكل قطرات.

ابدأ بتوصيل قسطرة مقاس 20 gauge بمحقنة سعة 1 مل. بعد التأكد من القتل الرحيم للفأر، افتح التجويف الصدري للحيوان وصولاً إلى الرقبة للكشف عن القصبة الهوائية للفأر ووضع القُنطرة فيها. من الضروري للغاية غسل الرئتين وإرواء القلب للتأكد من إزالة جميع البلاعم السنخية والخلايا أحادية النواة الملوثة الموجودة في الدم المحيطي.

وتأكد من تنفيذ الخطوتين التاليتين بعناية وبيد ثابتة بالطبع. الآن، قم بإعطاء PBS مبرد بالثلج مع EDTA ثلاث مرات عبر القسطرة لشطف الجهاز التنفسي السفلي وإزالة الخلايا من المسافات السنخية. بعد ذلك، وبعد تجهيز محقنة سعة 10 ملل بإبرة قياس 20، قم بتروية الرئتين بـ 10 ملل من PBS المحتوي على heparin عبر البطين الأيمن للقلب.

يُعتبر إزالة أي خلايا دم متبقية من الأوعية الدموية الرئوية مكتملة عندما تتحول الرئتان إلى اللون الأبيض. بعد ذلك، قم بإزالة العقد اللمفاوية المنصفية ووضعها في طبق منفصل. امنع إخماد الفلورية عن طريق تقليل تعرض الأنسجة للضوء.

بعد ذلك، قم بتشريح الرئتين المرويتين ووضعهما في طبق بتري، ثم استعمل المقص لفرم الرئتين. بعد ذلك، قم بهضم أنسجة الرئة عند 37 °C في 250 units/mL من collagenase D. وبعد 25 دقيقة من التحضين، أضف EDTA إلى الخليط لمدة خمس دقائق لإيقاف نشاط collagenase. وأخيراً، مرر قطع الرئتين المهضومة عبر مصفاة خلوية بمسامية 100 micron وقم بإزالة الكريات الحمراء باستخدام محلول منظم ناقص التوتر.

قم بفصل العقد اللمفاوية المنصفية باستخدام إبر دقيقة واهضمها باستخدام الكولاجيناز كما تم توضيحه للتو بالنسبة للرئتين، متبوعاً بتصفية الأنسجة من خلال مصفاة خلايا بعد إجراء التحسيس داخل الصفاق والمجاري التنفسية. يمكن تقييم وجود الخلايا الالتهابية عن طريق صبغ الهيماتوكسيلين والإيوزين في مقاطع رئوية ممثلة من المجموعة الضابطة.

في الحيوانات المعالجة بالمحلول الملحي، تخلو الأنسجة من الالتهاب كما يظهر في الرسم التوضيحي العلوي. وفي المقابل، تنتشر الخلايا الالتهابية في جميع أنحاء مقاطع الرئة من Val في الحيوانات المحسسة والمعرضة للمستضد كما يتضح في الجزء السفلي. ويمكن استخدام صبغة حمض البيروديك لتقييم إنتاج المخاط كما هو موضح في هذا الرسم التوضيحي السفلي.

يتم تأكيد تحفيز الالتهاب التحسسي في المجاري التنفسية عقب التحدي بـ val في الفئران التي تم تحسيسها بـ Val من خلال وجود المخاط. وعلى العكس من ذلك، يظهر غياب تام لإنتاج المخاط في الفئران التي عولجت بالمحلول الملحي كمجموعة ضابطة، كما هو موضح في الرسم البياني العلوي؛ فبعد التحدي بـ val، تخضع خلايا dcs الرئوية للنضج ثم تهاجر لاحقًا إلى العقد اللمفاوية التصريفية.

يظهر هنا تحليل تمثيلي للعقد الليمفاوية المنصفية للفئران أن هناك زيادة طفيفة ولكنها ثابتة في نسبة الخلايا الموجبة لـ CD 11 C تم رصدها في الحيوانات التي تم تحسيسها وتعريضها لـ Val Boomin مقارنة بالفئران المعالجة بالمحلول الملحي. علاوة على ذلك، فإن تحليل العدد المطلق للخلايا الموجبة لـ CD 11 C والموجبة لـ CD 11 B والموجبة لـ Val Boomin fits من العقد الليمفاوية المنصفية في الفئران التي تم تحسيسها وتعريضها لـ Val يظهر حدوث زيادة في أعداد DC بمقدار عدة أضعاف في الفئران المعرضة مقارنة بالحيوانات المعالجة بالمحلول الملحي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لدينا فهم جيد جداً لتقنيتنا المستخدمة في تحليل نضج الخلايا التغصنية الرئوية وكذلك هجرتها.

وبمجرد استيعابك التام لهذه التقنية، يمكنك الانتقال إلى تعديلها لتقييم استجابات الخلايا التغصنية الرئوية لمسببات أمراض أخرى، بالإضافة إلى عوامل تجريبية أخرى.