التخصيص الرشاشيات النيجر علم الصرف عن طريق إضافة من الجسيمات الدقيقة التلك

تعمل هذه الطريقة على توليد وتوصيف البنى المورفولوجية للفطر الخيطي، *Aspergillus niger*، المعتمدة على الجسيمات الدقيقة، وذلك لربط المورفولوجيا الفطرية بالإنتاجية. يتم استزراع *A. niger* بوجود أو غياب الجسيمات الدقيقة في مفاعل حيوي ذو خزان ممتزج سعة 3 لتر لمدة 72 ساعة لحساب الإنتاجية النوعية. تُؤخذ عينات في نقاط زمنية محددة لتحديد الكتلة الحيوية، والوزن الجاف، ونشاط إنزيم beta-fructosidase.

بعد مرور 72 ساعة، افحص المورفولوجيا الفطرية باستخدام المجهر وقم بتوصيفها عن طريق تحليل الصور الرقمية. ثم ادمج المعايير ذات الصلة لتحليل الصور في "رقم مورفولوجي" يرتبط رياضياً بالإنتاجية النوعية. وفي النهاية، يمكن لهذه الطريقة توليد وتوصيف مورفولوجيا *Aspergillus niger* بدقة وشمولية، وذلك لتحقيق فهم أفضل للتخلق المورفولوجي للكائنات الحية الدقيقة الخيطية.

يعتبر فطر Aspergillus Nigel بمثابة ركيزة صناعية هامة في مجال التكنولوجيا الحيوية منذ عدة عقود. وتعد المورفولوجيا المعقدة لفطر Aspergillus Nigel والأنواع ذات الصلة، والتي تتراوح من الكريات الكثيفة إلى الميسليا اللزجة اعتماداً على ظروف المزرعة، واحدة من أكثر الخصائص إثارة للاهتمام والتي غالباً ما يصعب التحكم فيها. وتكمن الميزة الرئيسية لإجراءاتنا في أننا أصبحنا قادرين، من خلال إضافة الجسيمات الدقيقة، على تفصيل المورفولوجيا الفطرية خصيصاً لتلبية احتياجات العملية.

حتى الآن، لم يتم وصف أي طريقة أخرى لمثل هذا التخصيص في المورفولوجيا الفطرية. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية حول استزراع الكائنات الدقيقة الخيطية. فبالنسبة للتطبيقات الصناعية، من الضروري التحكم في المورفولوجيا الفطرية، وكذلك التمييز بين المورفولوجيا الفطرية ذات الإنتاجية العالية وتلك ذات الإنتاجية المنخفضة.

يوفر البروتوكول الخاص بنا الوسائل اللازمة للتخصيص والتوصيف المرغوبين لمورفولوجيا الفطريات. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن تقدم رؤية تحليلية لمورفولوجيا aspergillus Nigel، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على الكائنات الحية الدقيقة الخيطية الأخرى مثل سلالات penicillium أو strepto. قم بتجهيز أربعة مفاعلات حيوية للمزارع المعقمة كما هو مفصل في البروتوكول المرفق.

نص يستند إلى إضافة الجسيمات الدقيقة، حيث يتم استزراع *Aspergillus niger* بمورفولوجيا مختلفة. وبعد مرور 72 ساعة، يتم نقل 50 milliliters من عينات مرق المزرعة إلى أنبوب فالكون.

يجب أخذ عينات الكتلة الحيوية في مكررات ثنائية على الأقل بعد التجفيف في المجفف، ثم يتم وزن مرشح السليلوز باستخدام الموازين الدقيقة. ضع المرشح في قمع بوخنر متصل بمضخة تفريغ نفاثة مائية، وقم بترشيح 10 milliliters من العينة، يليه 10 milliliters من الماء منزوع الأيونات لإزالة مركبات الوسط من الكتلة الحيوية، ثم قم بطي المرشح مرة واحدة من المنتصف.

ضعه في طبق بتري زجاجي وداخل مجفف مقصورة حتى ثبات الوزن. انقل المرشح إلى مجفف كيميائي واتركه ليبرد، ثم قم بقياس الوزن.

احسب الوزن الجاف للكتلة الحيوية لكل لتر عن طريق حساب الوزن، وفارق وزن المرشحات، ثم القسمة على حجم العينة من أجل مقايسات إنزيم جلوكوز أوكسيداز وبيروكسيداز. تُحفظ العينات على الثلج باستخدام سرنجة سحب سعة 1.5 milliliters. يتم تمرير معلق المزرعة عبر مرشح أسيتات السليلوز إلى أنبوب تفاعل لإجراء مقايسة beta fructo SASE.

نضمن الدقة والنجاح باستخدام عينتين مكررات ثلاث مرات لضمان القوة الإحصائية. لبدء المقايسة، أضف 20 µL من العينة إلى أنبوب الاختبار؛ ولضبط عملية تحلل السكروز إلى جلوكوز المعتمدة على pH ودرجة الحرارة، استخدم 20 µL من الماء منزوع الأيونات بدلاً من 20 µL من العينة. كما يجب تحضير ضابط سلبي لكل عينة للكشف عن الجلوكوز المتبقي في مرق المزرعة عن طريق المقايسة.

20 µL من العينة المثبطة حرارياً. لبدء تفاعل تحويل السكروز إلى جلوكوز، أضف 200 µL من محلول السكروز بتركيز 1.65 molar وبدرجة pH 5.4 إلى 20 µL من العينة، ثم حضن جميع أنابيب التفاعل في وحدة تسخين عند 40 °C لمدة 20 دقيقة. أوقف التفاعل بالتسخين عند 95 °C لمدة 10 دقائق بعد تبريد الأنابيب على الثلج.

قم بطرد العينات مركزياً عند الضرورة، وخفف العينات الخاصة بالمقايسة بحيث تكون الامتصاصية المقاسة ضمن نطاق القيمة المعايرة. الآن، أضف ميكرولترين من العينة إلى لوح معايرة دقيق (microtiter plate) لكل تفاعل. قم بإجراء قياسات العينات في ثلاث مكررات.

قم أيضاً بتحضير منحنى قياسي لـ 10 محاليل جلوكوز تتراوح تركيزاتها من 1 millimolar إلى 15 millimolar. وبالنسبة لمعايرة نقطة الصفر، استخدم 2 µL من الماء منزوع الأيونات. بعد ذلك، أضف 200 µL من محلول الكاشف إلى كل منها.

تُحضن الآبار لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يُقاس الامتصاص عند 450 nanometers باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة sunrise Microplate reader ذو 96 بئراً وبرنامج استرجاع البيانات Magellan. يُفتح مخطط النتائج باستخدام جدول بيانات، ويتم إنشاء خط معايرة لمنحنى قياسي.

احسب النشاط لكل عينة. ثم استخرج نشاط إنزيم beta fructosidase بطرح قيم الضابط السلبي المناسب من نشاط العينة. وأخيراً، احسب الإنتاجية النوعية من خلال إدخال الوزن الجاف للكتلة الحيوية ونشاط beta fructosidase في الحساب.

ضع ثلاثة ملليلتر من المعلق الزرعي في طبق بتري بلاستيكي وقم بتخفيفه باستخدام محلول كلوريد الصوديوم الفسيولوجي لفصل البنى المورفولوجية. تكتسب جودة الصور المجهرية أهمية استثنائية؛ لذا يجب توخي الحذر أثناء خطوة التخفيف لضمان دقة تحليل الصور اللاحق.

ضع طبق بيتري تحت المجهر المزود بكاميرا مدمجة. قم بالتقاط وحفظ حوالي 100 صورة للبنى المورفولوجية لكل عينة، مع التأكد من ظهور كائن واحد على الأقل بشكل كامل في كل صورة. استمر بنفس الطريقة مع الأطباق التي تحتوي على عينات من مفاعلات مختلفة، مع التقاط صور جديدة في كل مرة.

لاحظ شكل النمو المورفولوجي المختلف للعينات المأخوذة من مفاعلات مختلفة نمت بكميات متفاوتة من مسحوق التالك المضاف. ثم افتح جميع صور العينة نفسها في برنامج معالجة الصور Image J. وباستخدام أداة المعالجة، قم بتحويل الصور إلى ثنائية (binary).

قم بتحويل الصور إلى اللونين الأبيض والأسود لتطبيق الأمر على سلسلة كاملة من الصور. استخدم بعد ذلك رمز ماكرو، وافتح إحدى الصور التي تحتوي على شريط مقياس. ارسم خطاً مستقيماً عبر شريط المقياس لتحديد عدد البكسلات التي تقابل 2000 ميكرون.

اختر أداة التحليل (analyze tool)، وحدد القياس، ثم اختر عوامل الشكل (shape factors)، والقطر الفيريتي (ferrets)، والقطر والمساحة، والمحيط. استخدم رمز ماكرو (macro code) لمعالجة سلسلة من الصور. الآن افتح جدول البيانات الذي يرسم نتائج قيم عامل الشكل.

لكل صورة، احسب رقم المورفولوجيا لكل صورة مع جميع صور العينة الواحدة. احسب القيمة المتوسطة لرقم المورفولوجيا. استخدم برنامجاً للرسم البياني وتحليل البيانات لرسم رقم المورفولوجيا مقابل الإنتاجية النوعية.

حدد العلاقة الرياضية عن طريق الانحدار الرياضي من خلال إضافة تراكيز متزايدة من الجسيمات الدقيقة للتلك. ثمانية Niger SKAN 10 15. تتغير المورفولوجيا من مورفولوجيا الكريات الحقيقية إلى مورفولوجيا مشتتة أو حتى مورفولوجيا فطريات، بينما تظهر مورفولوجيا الكريات المتوقعة في الظروف القياسية.

ومن المثير للاهتمام أن مورفولوجيا الميسيليوم تتشكل عند تدعيم الوسط بـ 10 grams per liter من جسيمات التالك الدقيقة. وبالتزامن مع ذلك، يزداد نشاط Beto Fructo tase بمقدار ثلاث مرات تقريبًا، بينما يؤدي التدعيم بـ one أو three grams per liter من مسحوق التالك إلى مورفولوجيا متشتتة مع تضاعف نشاط الفركتوز باستخدام المعايير المحددة بواسطة التحليل التلقائي للصور. ويمكن وصف المورفولوجيا المعتمدة على الجسيمات الدقيقة بشكل شامل من خلال المورفولوجيا.

ملاحظة بشأن الرقم، حيث ستظهر الكريات الملساء المستديرة تماماً في الصور المجهرية كدوائر مثالية لهذه الجسيمات. تقترب قيمة رقم المورفولوجيا من الواحد في الظروف القياسية. ويظهر المورفولوجيا في المفاعل الأول رقماً مورفولوجياً يقارب 0.8.

المورفولوجيا في المفاعل الرابع بتركيز 10 غرام/لتر. يتميز مسحوق التلك بقيمة عدد المورفولوجيا حوالي 0.1. بينما تقع قيمة عدد المورفولوجيا للمفاعلين الثاني والثالث، بتركيزات مسحوق التلك التي تبلغ غرام واحد وثلاثة غرام/لتر، بين هذين الحدين، مما يظهر مورفولوجيا مشتتة.

بما أن المورفولوجيا المعتمدة على الجسيمات الدقيقة ترتبط ارتباطاً وثيقاً بإنتاجية خلايا بيتا الفركتوز، فهناك ارتباط رياضي جيد بين المورفولوجيا والعدد والإنتاجية بعد تطورها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التكنولوجيا الحيوية لمزيد من الاستكشاف لمورفولوجيا الفطريات، وخاصة علاقتها بالإنتاجية. وباتباع هذا الإجراء الخاص بالإنشاء التفصيلي لأنواع متقاطعة فطرية مورفولوجية محددة، يمكن استكشاف جوانب مهمة أخرى من زراعة الكائنات الدقيقة الخيطية.

فمن المعروف، على سبيل المثال، أن المورفولوجيا الميسيلية تكون أكثر لزوجة بكثير من المورفولوجيا الحنكِيّة. وبناءً على ذلك، تتأثر الإنتاجية العامة للعملية سلبًا بسبب المشكلات التي تواجه تنقية المنتج المطلوب. وسيساعدنا رقم المورفولوجيا الخاص بنا في وضع نماذج تتعلق بالاستزراع، والبروتوكولات، وتعزيز فهمنا للمورفولوجيا الفطرية بشكل عام.