الفشوت القوارض تقييم النسخ المتماثل وظيفة خلايا بيتا في Adenovirally-transduced المعزولة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد مسارات التأشير التي تنظم التغيرات في كتلة خلايا بيتا الوظيفية. ويتم تحقيق ذلك في جزر لانجرهانز المعزولة من الجرذان عن طريق زيادة التعبير عن جين معين أو تثبيط التعبير عنه باستخدام النواقل الغدانية. وبعد هذا التلاعب، يتم تقييم وظيفة خلايا بيتا من خلال إفراز الإنسولين، كما يتم قياس تضاعف جزر لانجرهانز عن طريق دمج الثيميدين الموّسم بالتريتيوم.

في نهاية المطاف، يمكن لهذه المقايسات أن تبين ما إذا كان الجين المستهدف ينظم تكاثر خلايا بيتا و/أو وظيفتها في المختبر (in vitro). ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال بيولوجيا الجفن، مثل: هل يؤثر مكون معين من مسار تأشير خلوي على نمو خلايا بيتا ووظيفتها؟ قم بتحضير طبق سداسي الفجوات غير مطلي لمزارع الأنسجة عن طريق إضافة 2 mL من الوسط المعدل إلى العدد المطلوب من الفجوات.

على سبيل المثال، قد تتطلب التجربة النموذجية ثلاثة آبار، واحد لكل من ضابط خلو من الفيروس، وضابط مصاب بالفيروس، والمجموعة التجريبية. يتم تدفئة الطبق عند 37 °C في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 30 دقيقة على الأقل. مباشرة بعد عزل عُنيقات العين للجرذ، يتم وضع من 1 إلى 200 عُنيقة في كل بئر من آبار الطبق المجهز. سيتم استخدام 60 عُنيقة للمقاييس الكيميوحيوية، ويمكن استخدام العُنيقات المتبقية لدراسات التعبير الجيني أو التلطيخ المناعي. يتم رج الطبق بلطف لجعل العُنيقات تستقر في مركز كل بئر.

بعد ذلك، قم بنقل الفيروس الغدي مباشرة بواسطة الماصة فوق العروات، في مركز الطبق. استخدم تعدديات عدوى تتراوح من 1 إلى 500، بناءً على فعالية الفيروس الغدي في زيادة تعبير أو تثبيط البروتين المستهدف.

يؤدي النفاذ الفعال للفيروس الغدي إلى قلب الجفن إلى زيادة اتساق النتائج. ومن الضروري إجراء عملية ترنسدكشن (transduction) للجفون فور الانتهاء من عملية عزل الجفن.

لا تقم بتحريك الطبق لمدة خمس دقائق، ثم انقله إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة. وفي اليوم التالي، أخرج الطبق من الحاضنة وقم بتوسيع الحلقات بلطف باتجاه مراكز الآبار. انقل الحلقات إلى بئر جديدة تحتوي على وسط غذائي جديد باستخدام ماصة ميكرولترية سعة 200 µL.

إذا التصقت العروات بالصفيحة، فيمكن إزاحتها برفق باستخدام رأس الماصة. ومن المفيد استخدام فيروس ضابط يعبر عن GFP للتحقق من كفاءة التنصيب المناسبة، وذلك باستخدام المجهر البؤري لتصوير تغلغل الفيروس الغدي في استزراع لب الجزر. تُترك الجزر لمدة تتراوح من يوم إلى ثلاثة أيام إضافية، مع تغيير الوسط يومياً.

يجب تحسين مدة الزرع من خلال الدراسات الاستطلاعية، وهي تختلف بناءً على الأهداف التجريبية. خلال الـ 24 ساعة الأخيرة، أضف الثيميدين المسمى بالتريتيوم إلى الوسط بتركيز 1 micro curie لكل مليمتر من الوسط. أولاً، قم بتحضير 50 milliliters من محلول SAB العامل في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter وسخنه في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C.

انقل 10 milliliters من وسط SAB العامل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter وأضف 66.8 µL من D glucose بتركيز 2.5 molar. ولتحضير وسط SAB عالي الجلوكوز، أضف 44.8 µL من D glucose بتركيز 2.5 molar إلى الـ 40 milliliters المتبقية من وسط SAB العامل. ولتحضير وسط SAB منخفض الجلوكوز، قم بعد ذلك بتسمية ثلاثة أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.7 milliliter.

لكل بئر من ألواح الستة آبار، أضف 1 مل من PBS إلى كل أنبوب. لا تنسَ اتباع البروتوكولات المؤسسية الخاصة بالتعامل مع العنيقات المشعة والتخلص منها. باستخدام مجهر ستيريوسكوبي أو مجهر قياسي، اختر وانقل 20 عينة من العنيقات متقاربة الحجم إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق.

على سبيل المثال، قد يحتوي كل أنبوب على خمس حلقات عين صغيرة، و10 حلقات متوسطة، وخمس حلقات كبيرة الحجم. وعلى الرغم من تطبيع النتائج بالنسبة إلى محتوى البروتين الكلي في نهاية التجربة، فمن الضروري مطابقة أحجام حلقات العين بين المجموعات. وبعد السماح لحلقات العين بالترسب في قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية أو باستخدام جهاز الطرد المركزي، يتم سحب ووزن PBS باستخدام ماصة دقيقة، ثم البدء في تحضير حلقات العين للمقايسات الكيميائية الحيوية.

لتحضير العنيقات (eyelets) لاختبار إفراز الإنسولين، يجب أولاً تحضينها مسبقاً مع وسط SAB منخفض الجلوكوز. وللقيام بذلك، أضف 400 µL من وسط SAB منخفض الجلوكوز إلى الأنابيب وضعها مع إغلاق الأغطية في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 60 دقيقة. بعد مرور ساعة، اسحب وسط SAB منخفض الجلوكوز المستخدم في التحضين المسبق. ولقياس إفراز الإنسولين القاعدي، كرر إجراء التحضين المسبق.

ومع ذلك، لقياس إفراز الأنسولين المحفز، استخدم 400 µL من وسط SAB عالي الجلوكوز بدلاً من وسط SAB منخفض الجلوكوز، وكما سبق، قم بتحضين الجزر لـ 60 دقيقة، ثم بعد التحضين في وسط SAB عالي أو منخفض الجلوكوز، اسحب وسط SAB لإجراء المقايسة المناعية الشعاعية للأنسولين، والتي سيتم تنفيذها وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. ثم انتقل إلى مقايسة دمج الثيميدين باستخدام نفس مجموعة الجزر. ابدأ بالجزر التي استُخدمت للتو في مقايسة إفراز الأنسولين.

أضف 1 mL من PBS واترك الثقوب تستقر بفعل الجاذبية. بعد ذلك، اسحب PBS باستخدام ماصة دقيقة. تخلص من المحلول وكرر هذه الخطوة مرة أخرى.

بعد ذلك، أضف 500 µL من حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك المبرد بالثلج إلى العينات، ثم حضنها على الثلج لمدة 30 دقيقة. قم بطرد مركزي للأنابيب عند درجة حرارة 4 °C، ثم اسحب وتخلص من حمض TCA.

بعد ذلك، أضف 80 µL من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.3 normal واحضن العنيقات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وخلال فترة الحضن هذه، قم برج العينات بقوة باستخدام جهاز vortex لمدة تتراوح من 5 إلى 10 ثوانٍ كل 10 دقائق. وبالتوازي مع ذلك، أضف 4 mL من سائل العد Conno Safe إلى أنابيب عد الوميض السائل سعة 7 mL.

عند انتهاء حضن العينات، أضف 50 µL من العينات إلى أنبوب وميضي. رُج الأنبوب المغلق لفترة وجيزة وقس النشاط الإشعاعي للعينات باستخدام عداد وميضي سائل. ولتحديد تركيز البروتين، انقل 10 µL من العينات إلى مقايسة حمض bionic تجارية واتبع بروتوكول الشركة المصنعة.

لاحقاً أثناء تحليل البيانات، قم بتطبيع النتائج وفقاً لتركيز البروتين باستخدام البروتوكولات الموضحة. تكاثر الجزر البنكرياسية ووظيفة خلايا بيتا. في جزر الفئران، تم تقييم التعبير المفرط للفيروس الغدي للجين الافتراضي ستة، والذي حفز بقوة تكاثر الجزر دون تغيير وظيفة خلايا بيتا.

زيادة تعبير الجين six، وزيادة تخليق DNA كما تم قياسه عن طريق دمج thymidine لأن معظم الخلايا في جزيرة العين للجرذ هي خلايا بيتا. ويمكن أن تظهر التجارب الإضافية أن هذه الزيادة في دمج thymidine تعود إلى زيادة تضاعف خلايا بيتا. وأظهر مقايسة إفراز الإنسولين أن الإفراط في تعبير الجين six لم يغير إحدى الوظائف الأساسية لخلايا بيتا وهي إفراز الإنسولين عند المستويات المنخفضة والعالية من الجلوكوز.

تعكس الزيادة في إفراز الإنسولين عند التركيزات المنخفضة والعالية للجلوكوز حالة الجزر بعد المعالجة بالفيروس الغدي. وإذا كان زيادة تعبير الجين six تؤدي إلى ضعف وظيفة خلايا بيتا، فمن المرجح أن ينعكس ذلك في شكل انخفاض في كمية الإنسولين المفرزة عند تركيزات الجلوكوز العالية المحفزة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس تضاعف خلايا بيتا وإفراز الإنسولين لتحديد ما إذا كان جين معين يؤثر على نمو خلايا بيتا أو وظيفتها.