النمذجة التهاب القولون المتعاونة مع السرطان مع Azoxymethane (AOM) ودكستران كبريتات الصوديوم (DSS)

في اليوم صفر، تم حقن الفئران بمادة azoxymethane أو OM في الأسبوع التالي. ثم يتم استبدال مياه الشرب الخاصة بها بمحلول يحتوي على dextran sulfate sodium أو DSS. وفي الأسبوع الثالث، يتم إعطاء الفئران مياه شرب عادية لمدة الأسبوعين التاليين.

تُكرر دورة المياه التي تحتوي على DSS مرتين إضافيتين. وبعد دورة DSS الثانية، يمكن تقييم الفئران للكشف عن الأورام عن طريق التنظير الداخلي المرآتي.

بعد الأسبوع العاشر، يتم تضحية الفئران واستئصال القولون. يتم غسل القولون وفتحه طولياً. ثم يتم تقييم القولون من حيث حجم الأورام وعددها.

يمكن تضمين مقطع طولي من القولون مقسم إلى أثلاث وتقديمه للتحليل النسيجي. وباستخدام المجهر الضوئي، يمكن عد الأورام وتصنيفها. نحن نستعرض بروتوكولاً يتم فيه إعطاء العامل السام للجينات OM، يليه ثلاث دورات من العامل المحفز للالتهاب.

يؤدي DSS بسرعة وبشكل ثابت إلى توليد أورام في القولون لدى الفئران، مع وجود تشابهات مورفولوجية وجزيئية مع تلك التي تظهر في سرطان القولون المرتبط بالتهاب القولون لدى البشر. يتم تمييز الفئران بشكل فردي باستخدام علامات على الذيل أو قصاصات من الأذن في اليوم صفر، وتسجيل الوزن الأساسي لكل فأر في جدول، ثم حقن كل فأر بمحلول بتركيز 10 milligram per kilogram من OM exercise. يجب توخي الحذر عند التعامل مع OM لأنه عامل سمي جيني. وفي اليوم السابع، يتم تزويد الفئران بمحلول DSS بتركيز 2.5% كمياه شرب للأسبوع التالي. لتحضير هذا المحلول، يُضاف مسحوق DSS إلى الماء المقطر ويُخلط حتى الذوبان.

يكون المحلول جاهزاً بعد تمريره عبر مرشح أسيتات السليلوز بمسامية 0.2 ميكرون. ولضمان توفير إمداد مستمر من محلول DSS لمدة سبعة أيام، استبدل محلول DSS كل يومين إلى ثلاثة أيام.

بعد هذه الفترة، أعد الأقفاص إلى نظام المياه لمدة أسبوعين. قم بوزن الفئران مرتين إلى ثلاث مرات أسبوعيًا، وراقب ظهور أي نزيف شرجي أو إسهال. قد تعاني الفئران التي لديها أورام كبيرة من تدلي شرجي مؤقت، إلا أن هذا لا يقلل عمومًا من نسبة البقاء على قيد الحياة.

يُستخدم فقدان الوزن بالنسبة إلى خط الأساس كمقياس بديل لشدة التهاب القولون. ويمكن توقع فقدان في الوزن يصل إلى 10%، مصحوباً بالإسهال ونزيف شرجي لمدة تتراوح بين يومين وثلاثة أيام في الأسبوع الذي يلي دورة كاملة من تنظير القولون باستخدام DSS. ويمكن إجراء الدورة الثانية أو الثالثة من DSS لتأكيد نمو الورم داخل الجسم الحي (in vivo) قبل التضحية بالحيوان.

بما أن نموذج A-O-M-D-S-S موثوق للغاية في إحداث الأورام، فإن هذه الخطوة غير ضرورية بشكل عام. يجب تقييم عدد قليل فقط من الفئران باستخدام هذه الطريقة لأنها قد تؤدي إلى تعطيل أورام الفئران. يجب أن تتضمن منطقة العمل الخاصة بك كأساً من المحلول الملحي الفوسفاتي المنظم المعقم أو PBS بالإضافة إلى كأس فارغ.

للتخلص من محلول PBS المستخدم، اسحب من 8 إلى 10 milliliters من PBS في محقنة وقم بتوصيلها بالمنظار لكل استخدام. ولغسل المحتويات داخل اللمعة، قم بتخدير كل فأر عن طريق التخدير الاستنشاقي أو الحقني، وثبّت الفأر على لوح مسطح باستخدام شريط لاصق عند الذيل والصدر، ويمكن ضغط وسادات أقدام الفأر. ولضمان التخدير الكافي، استخدم إبهامك وسبابتك لضغط أسفل بطن الفأر لكشف الشرج، ثم أدخل منظار muren في مستقيم الفأر.

استخدم محلول PBS برفق للنفخ والإرواء لتحسين الرؤية داخل التجويف وإزالة المحتويات البرازية. استمر في دفع المنظار ببطء مع مراقبة الشاشة. وبالنسبة لوجود أورام عيانية في اليوم 70، يجب أن تحمل كل فأرة معالجة بـ A-O-M-D-S-S أوراماً متعددة في القولون وأن تكون جاهزة للتقييم.

يمكن تأخير هذه الحالة لأسابيع أو أشهر إذا كانت الأورام الأكبر حجماً هي المطلوبة. قم بتجهيز حقنة مملوءة بـ PBS متصلة بإبرة تغذية أنبوبية. حقنة محملة بـ 10% formalin ومقص جراحي أساسي، ومقصات ذات رؤوس مستديرة.

حقنة صغيرة محملة بمحلول Ian Blue بتركيز 1% وملقط دقيق. كما يتم تحضير صينية تبريد، وقارب نقل يحتوي على PBSA مبرد، وشفرة حلاقة جديدة للتقطيع، وحوض تثبيت مملوء بـ 10% formalin. يتم القتل الرحيم لكل فأر عن طريق isof, fluorine والخلع العنقي أو أي طريقة أخرى معتمدة مؤسسياً. ويمكن إجراء قياس الوزن النهائي والقياسات الأخرى.

في هذه المرحلة، ضع الفأر على لوح تقطيع بحيث يكون الجانب البطني مكشوفاً. رُش منطقة البطن بـ 70% ethanol لإبعاد الشعر عن منطقة التشريح. استخدم الملقط للإمساك بخط منتصف البطن، ثم قم بإجراء شق صغير عبر الجلد للكشف عن البريتون.

استخدم شداً لطيفاً لفصل الجلد عن الصفاق وكشف التجويف البطني بالكامل. قم بإجراء شق في الصفاق ومد هذا الشق على طول الحافة الضلعية من الجانبين. استخدم مقصاً مغلقاً لإزاحة الأمعاء الدقيقة والقولون إلى الجانب.

سيؤدي ذلك إلى كشف العقد اللمفاوية المساريقية، والتي يمكن استئصالها اختيارياً. ولغرض التقييم، قم بإزاحة الجهاز البولي التناسلي نحو الأسفل لكشف القولون النازل والمستقيم، واستأصل المثانة والأعضاء التناسلية حسب الضرورة لمزيد من كشف الحوض، مع الحرص على عدم تمزيق الأنسجة المجاورة.

اقطع عبر الراميين العانيين السفلي والعلوي للكشف عن الوصل الشرجي المستقيم. اقطع الجلد حول الوصل الشرجي المستقيم لتحرير القولون مع تطبيق شد علوي لطيف. وباستخدام ملقط المساريق، يمكن استئصال ارتباطات القولون أو فصلها بعناية.

من المهم الاحتفاظ بجزء من الجلد عند الموصل الشرجي المستقيم، حيث أن هذه المنطقة غالباً ما تتأثر بتنسج الخلايا. قم بقطع الأمعاء الغليظة عن الأمعاء الدقيقة في نقطة تسبق الأعور مباشرة. افصل الأعور عن القولون المجاور باستخدام إبرة تغذية من عيار 18 متصلة بمحقنة سعة 5 ml.

قم بغسل القولون باستخدام PBS بارد جداً بحيث يخرج السائل في الاتجاه الفسيولوجي باستخدام مقص ذو حواف مستديرة. افتح القولون على طول مسراقه، ثم قم بفرد القولون المفتوح فوق الصينية الباردة.

تأكد من ذوبان الصينية بشكل كافٍ لضمان عدم تجميد الأنسجة. ضع بضع قطرات من صبغة Ian Blue بتركيز 1% باستخدام الإصبع لتحسين رؤية الأورام. قم بتقييم عدد الأورام وحجمها باستخدام المسطرة أو التقط صوراً فوتوغرافية لإجراء التحليل الرقمي.

يمكن استئصال مقاطع صغيرة من الورم والأنسجة الطبيعية المجاورة في هذه المرحلة لإجراء تحليلات مستقبلية باستخدام طرق تحليل البروتين في RNA أو الطرق الكيميائية النسيجية المناعية، مع ترك جزء من القولون للتقييم النسيجي. يتم وضع فورمالين 10% في القولون المتبقي على الصينية الباردة بواسطة حقنة أو الإصبع، وترك النسيج ليتم تثبيته لمدة 30 ثانية على الأقل. وبهذه الطريقة، يتم تسهيل عملية النقل إلى حوض التثبيت.

تأكد من مسح بقايا الفورمالين قبل رسم القولون المفتوح الجديد على نفس الصينية. انقل القولون إلى حوض مليء بـ 10% formalin وثبته بالدبابيس من الحواف. بعد ثلاث ساعات من التثبيت، تخلص من formalin واستبدله بـ 70% ethanol.

يمكن حفظ القولون في ethanol بنسبة 70% لفترة غير محدودة. استخدم حرارة منخفضة لتحضير محلول agar بنسبة 2%، وضع شريحة نظيفة جانباً على لوح زجاجي. قم بتقطيع القولون المثبت إلى ثلاثة أجزاء، وأعد القطع غير المستخدمة إلى حوض الـ ethanol.

قم بتقليم المقاطع إلى حجم موحد باستخدام شفرتين. ثبّت مقاطع وطبقات القولون في الآغار على شريحة نظيفة. كرر هذه العملية للقولون التالي.

قم بقص المقطع العرضي، وإزالة الآجار الزائد، ووضع القولون المغمور في كاسيت للمعالجة والصبغ بـ hematin and eoin. يوضح الشكل الأول بروتوكول تحفيز سرطان القولون المرتبط بالتهاب القولون. يوضح الشكل الثاني وزن الفأر بالنسبة للوزن الأساسي أثناء إعطاء OM و DSS.

لاحظ أنه في الأسبوع الذي يلي كل دورة من DSS، تفقد الفئران من 5 إلى 10% من وزن أجسامها. ويُعد فقدان الوزن في هذه التجربة مؤشراً بديلاً لشدة التهاب القولون. يوضح الشكل ثلاثة مشهداً للأورام في القولون البعيد عبر تنظير القولون للفئران في اليوم 50 من العلاج بـ A-O-M-D-S-S.

لاحظ الكتل السليليّة المتعددة التي تسد لمعة القولون البعيد في اللوحتين B وC مقارنة بالقولون الطبيعي. وتُظهر اللوحة (أ) في الشكل 4 قولون فأر مفتوح طوليًا يوضح المظهر العياني للأورام. لاحظ العبء الورمي الأعلى في القولون البعيد والقوام المرقق المميز للقولون الداني مع نمو ورامي ضئيل.

يوضح الشكل خمسة الأورام التي تم إبرازها عن طريق تطبيق صبغة lc والصبغة الزرقاء. لاحظ كيف تعمل الصبغة على إبراز النسيج الطبيعي للقولون بالإضافة إلى حدود كل ورم على حدة. يمكن أن يكون هذا التلوين مفيداً في القياس الدقيق لمساحات الأورام باستخدام المسطرة أو القياس الرقمي.

يوضح الشكل ستة التوزيع التمثيلي لمتوسط عدد الأورام لكل فأر تمت معالجته بـ OM و DSS. يُلاحظ أن غالبية الأورام تقع في القولون distal، ويزيد حجمها عن مليمتيرين. يوضح الشكل سبعة مقاطع طولية من القولون مثبتة في البارافين داخل علبة كاسيت وشريحة مصبغة بـ h and E.

لاحظ أن بقايا صبغة S والصبغة الزرقاء لا تتداخل مع صبغة h و e. تم وضع دائرة حول ورم كبير في صورة الشريحة. وتنتج التسميات "القاصي" و"الأوسط" و"الداني" من تقسيم القولون بأكمله إلى ثلاثة أجزاء بين الأعور والشرج.

يظهر الشكل ثمانية النسيج المميز لورم ناتج عن إعطاء OM وDSS في القولون البعيد. الصور المجهرية المعروضة مصبوغة بـ H و E-B-R-D-U وbeta-catenin، وتوضح تغيرات خللية تشبه الأورام الغدية في القولون لدى البشر. لقد استعرضنا في هذا الفيديو بروتوكولاً لتحفيز تكون أورام قولونية مدفوعة بالالتهاب في الفئران، وذلك باستخدام حقنة واحدة من OM تليها ثلاث دورات من DSS، مدة كل منها سبعة أيام.

على مدار فترة زمنية تبلغ 10 أسابيع، يحفز هذا النموذج تكوين أورام ذات تغيرات نسيجية وجزيئية تشبه إلى حد كبير تلك التي تحدث في سرطان القولون المرتبط بالتهاب القولون لدى البشر، مما يوفر نموذجاً ذا قيمة عالية لدراسة نشوء الأورام والوقاية الكيميائية من هذا المرض.