A الفحص انجذاب غلفاني لتحليل حركية العصبية السلائف الهجرة خلية في الحقل الحالي مباشرة التطبيقية خارجيا الكهربائية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور هجرة الخلايا السلفية العصبية المشتقة من البالغين في وجود مجال كهربائي بتيار مستمر. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال عزل واستزراع الخلايا السلفية العصبية تحت البطانية من الفأر البالغ. والخطوة التالية هي تحضير غرف Galvan Axxis ونقل الخلايا السلفية العصبية إلى هذه الغرف.

تتمثل الخطوة النهائية في تطبيق مجال كهربائي بتيار مستمر عبر غرفة Galvan Axxis وإجراء تصوير زمني (time-lapse imaging) لمراقبة هجرة السلائف العصبية. وفي النهاية، يلتقط المجهر ذو التصوير الزمني خصائص التوجه الجلفاني (Galvan tactic properties) للسلائف العصبية في حالاتها المتمايزة وغير المتمايزة. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول ظاهرة galvan oasis في الخلايا السلفية العصبية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى، مثل نموذج سكتة دماغية في الفئران لدراسة استقطاب السلائف العصبية إلى مواقع الإصابة لتعزيز الإصلاح العصبي.

سيقوم روب بيلي بوست، وهو طالب دراسات عليا من مختبري، بتوضيح هذا الإجراء. عند البدء في هذا الإجراء، يجب أن تكون الخلايا السلفية العصبية (NPCs) قد بقيت في المزرعة لمدة سبعة أيام، لضمان جاهزية الكريات العصبية الأولية ذات الطفو الحر للحصاد. وعند الحاجة، ابدأ في تجهيز ثلاث غرف Galvan Axxis عن طريق وضع ثلاث قطع زجاجية مربعة.

أولاً، يتم غمر شرائح التغطية في زجاجة تحتوي على حمض الهيدروكلوريك بتركيز 6normal طوال الليل. وفي وقت مبكر من اليوم التالي، يتم تحضير matra gel ليذوب ببطء على الثلج. وبعد مرور أربع ساعات، سيكون جاهزاً للاستخدام لبناء الغرفة.

أولاً، استخدم قاطع زجاج برأس ماسي لقص ست شرائح زجاجية مستطيلة من مربع جديد. رقم واحد، شرائح التغطية. انقل شرائح المربع والشرائح المستطيلة المغسولة بالحمض إلى غطاء التدفق الصفائحي.

اغسل الشرائح الزجاجية باستخدام ethanol بتركيز 70% ثم بماء معقم مخصص للزراعة النسيجية. اتركها لتجف في الهواء أو جففها باستخدام ورق خالٍ من الوبر. بعد ذلك، ضع شحم التفريغ على محيط أحد سطحي كل شريحة زجاجية مربعة وأغلقها بإحكام على قاعدة بلاستيكية بقطر 60 millimeter.

أطباق بتري. ضع شحم التفريغ على أحد جانبي الشرائح الزجاجية المستطيلة وأحكم تثبيتها على الحواف المتقابلة من المربع. شرائح زجاجية لإنشاء مربعات ذات مجرى مركزي في منتصف كل طبق.

قم بتعقيم هذه المربعات أو الغرف الزجاجية المعدلة باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 15 دقيقة على الأقل داخل غطاء التدفق الصفحي. بعد ذلك، انقل بواسطة الماصة من 250 إلى 300 µL من polyol lysine إلى المجرى المركزي للغرف. ثم قم بحضن الغرف في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين، وذلك قبل حوالي 15 دقيقة من انتهاء عملية الحضن.

قم بتحضير محلول الـ Matrigel بعد مرور ساعتين، ثم اسحب مادة poly-L-lysine واغسل الأخاديد المركزية باستخدام 1 mL من المياه المقطرة والمعقمة (autoclave water). بعد ذلك، انقل من 250 إلى 300 µL من محلول Matrigel إلى الأخاديد المركزية، ثم قم بتحضين الغرف عند 37 °C لمدة ساعة واحدة. بعد انتهاء التحضين، اسحب محلول الـ Matrigel.

ثم اغسل الأخاديد المركزية برفق باستخدام 1 إلى 2 ملليلتر من SFM. الآن، ضع 100 ميكرولتر من E-F-H-S-F-M أو F-B-S-S-F-M بواسطة الماصة على الأخاديد المركزية تحضيراً للخلايا المستزرعة. بعد ذلك، ضع 4 إلى 5 ملليلتر من المزرعة التي تحتوي على الكرات العصبية في طبق بتري جديد بقطر 60 مليمتر.

بعد ذلك، ضع طبق بتري على منصة مجهر العد تحت الشيئية العينية بقوة تكبير 5x. استخدم ماصة P 10 لنقل خمس إلى ثماني كرات عصبية كاملة برفق إلى المجرى المركزي لكل حجرة. بحد أقصى أربع.

يمكن نقل الكرات العصبية دفعة واحدة، ولكن تجنب دمجها مع الكرات العصبية الموجودة في الأحواض المركزية. قم بتوزيعها بعناية حول المنطقة دون تعريض طبقة الماتريجيل (matrigel) للاضطراب. ثم أضف 150 µL إضافية من وسط E-F-H-S-F-M أو F-B-S-S-F-M فوق الأحواض المركزية.

الآن، يتم استزراع الخلايا في حاضنة رطبة. وبعد مرور 17 إلى 20 ساعة من الاستزراع، ستكون الخلايا العصبية السلفية (NPCs) غير المتمايزة متاحة بعد 69 إلى 72 ساعة. وفي الاستزراع، ستكون الخلايا العصبية السلفية (NPCs) المتمايزة متاحة.

باستخدام المجهر العددي، اختر الغرفة التي تحتوي على أفضل الخلايا لتحليل هجرة الخلايا الحية بالتصوير المجهري. يجب أن تكون الخلايا مستديرة ومنفصلة تقريبًا بشكل كامل عن كراتها العصبية، وألا تكون قد بدأت بعد، أو بدأت لتوها فقط، في تكوين استطالات داخل غطاء المختبر. قم بتجهيز غطاء الغرفة.

اغسل غطاء شريحة زجاجية مربعة بـ 70% ethanol، ثم بالماء المعقم بجهاز الأوتوكلاف وقم بوضع شريط من شحم الفراغ (vacuum grease) على حافتين متوازيتين. الآن قم بتغطية الحجرة. أولاً، قم بشفط وسائط الزرع من الميزاب المركزي، ثم أغلق الغطاء بسرعة، وثبت الشريحة على الجدران المستطيلة مثل السقف.

بعد ذلك، وباستخدام الخاصية الشعرية، يتم تحميل 100 microliters من الوسط الغذائي الطازج في المجرى المركزي. الآن، استخدم شحم الفراغ لإنشاء حدود لبرك الوسط الزرعي. عند كل طرف من أطراف المجرى المركزي في نظام تصوير الخلايا الحية، جهز أنابيب هلام الأجار، وأقطاب الفضة وكلوريد الفضة، وطبقين من أطباق بتري بقطر 60 millimeter لاستخدامهما.

باعتبارها خزانات للأوساط الزرعية، اترك الحجرات لترتاح داخل بيئة بدرجة حرارة 37 degrees Celsius و5%carbon dioxide لمدة 20 إلى 30 دقيقة. خلال هذا الوقت، قم بتجهيز أغطية طبقين فارغين من أطباق Petri وغطاء طبق Petri الخاص بحجرات Galvan Axxis عن طريق ثقبها باستخدام أداة Dremel أو أداة ثقب الماصات، ثم أضف من 1.5 إلى 2 milliliters من الوسط الزرعي على كلا جانبي الميزاب المركزي وأضف من سبعة إلى ثمانية milliliters من SFM في كل طبق Petri فارغ. ضع طبق Petri واحدًا على كل جانب من الميزاب المركزي للحجرة وضع قطبًا كهربائيًا واحدًا في كل طبق.

قم بسد الفجوة بين الغرفة وأطباق بتري لإنشاء استمرارية كهربائية. باستخدام جسور هلام Agros، صِل الأقطاب الكهربائية بمصدر طاقة خارجي مع توصيل مقياس M على التوالي لقياس التيار الكهربائي، ثم قم بتشغيل مصدر الطاقة. استخدم مقياس جهد لقياس قوة المجال الكهربائي مباشرة عبر الميزاب المركزي.

اضبط مخرج وحدة تزويد الطاقة حسب الحاجة. ابدأ الآن تشغيل وحدة التصوير المتقطع (time-lapse) في نظام التصوير. في برنامج Axio vision، اختر "الاستحواذ متعدد الأبعاد" (multidimensional acquisition) ثم انقر على "see".

بالنسبة للقنوات، اختر القناة السادسة، ثم انقر على T للتصوير الزمني (time lapse). اضبط إعدادات الفاصل الزمني للتصوير الزمني على دقيقة واحدة، واضبط المدة على ثماني ساعات في حقول الإعدادات "قبل" و"بعد" نقطة زمنية محددة، ثم اختر نقطة الزمن السابقة واللاحقة. الآن انقر على بدء واترك التجربة تعمل للمدة المطلوبة، وبعد اكتمال المقايسة، انتقل إلى تحليل الكيمياء النسيجية المناعية (IHC).

وكشف التحليل الكينماتيكي أنه في وجود مجال كهربائي مستمر (DCEF) بقوة 250 millivolt per millimeter، تُظهر الخلايا السلفية العصبية (NPCs) غير المتمايزة توجهاً غالوانياً سريعاً وموجهاً للغاية نحو الكاثود عند شدة المجال هذه، حيث هاجر أكثر من 98% من الخلايا السلفية العصبية غير المتمايزة طوال فترة التصوير التي استمرت من ست إلى ثماني ساعات. أما في غياب A-D-C-E-F، فقد لوحظت حركة عشوائية للخلايا.

بما أن الخلايا الميتة لا تهاجر، فإن هذا يشير إلى أنها تظل حيوية خلال هذه الفترة. وفي ظل غياب أو وجود A-D-C-E-F، أظهرت الأنماط الظاهرية المتمايزة هجرة ضئيلة، سواء في وجود أو غياب المجموعات الفرعية A-D-C-E-F من الخلايا المتمايزة. وقد مالت الاستطالات الممتدة إلى الاصطفاف بشكل عمودي على اتجاه DCEF، ولكن لم يُلاحظ أي انتقال ملموس في جسم الخلية.

أكد الصبغ المناعي أن الخلايا السلفية العصبية (NPCs) حافظت على تعبير إيجابي لعلامة الخلايا السلفية العصبية nestin بعد ست ساعات من التعرض للمجال الكهربائي للتيار المستمر (DC EF). وفي المقايسات التي تضمنت تحفيز الخلايا السلفية العصبية للتمايز إلى أنماط ظاهرة ناضجة، عبرت غالبية الخلايا عن علامة الخلايا النجمية الناضجة، وهي البروتين الحمضي الليفي الدبقي أو GFAP، بعد ست ساعات من التعرض لـ DCEF. وبعد هذا الإجراء، يمكن اكتساب رؤى حول الآليات الخلوية المشاركة في تحويل المجال الكهربائي للتيار المستمر إلى حركة خلوية باستخدام نماذج التعطيل الجيني.

أو يا سيدي، على سبيل المثال.