تحليل للهجرة كريست العصبية والتمايز بواسطة الصليب الأنواع زرع

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطعيم قطعة مستأصلة من الأنبوب العصبي الظهري من جنين سمان في جنين دجاج متوافق في المرحلة العمرية، وذلك لتتبع هجرة ومصير خلايا العرف العصبي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إحداث ثقب صغير في غشاء IGN لجنين الدجاج المضيف للوصول إلى الأنبوب العصبي. بعد ذلك، يتم إخراج جنين السمان المانح من بيضته لتحضيره لاستئصال الطعم.

في الخطوة التالية، يتم استئصال المنطقة المستهدفة من الأنبوب العصبي للجنين المضيف. ثم يتم استئصال منطقة مماثلة من الأنبوب العصبي للمانح لغرض التطعيم. بعد ذلك، يتم نقل الأنبوب العصبي للمانح وزراعته في الأنبوب العصبي للمضيف.

أخيراً، يتم تحضين الجنين الخيمري حتى المرحلة المطلوبة للكشف عن وصول خلايا العرف العصبي إلى العضو المختار. وفي نهاية المطاف، يمكن تصور هجرة وتمايز خلايا العرف العصبي المشتقة من المتبرع في مواقع مختلفة من جنين المضيف من خلال مجهر الفلورة المناعية. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات التشريح الدقيق والترقيع تتطلب مهارات حركية دقيقة جداً، مما يجعل تعلمها صعباً.

ابدأ بغسل أي شوائب من بيض الدجاج باستخدام ماء فاتر. رتب البيض أفقياً على صينية، ثم حدد الجوانب الموجهة للأعلى باستخدام قلم رصاص للإشارة إلى المنطقة التي سيتمركز فيها الجنين. لتحضير أجنة مانحة بطريقة X ovo، يتم تحضين أرجل السمان بحيث يكون الجانب غير المدبب للأسفل.

بعد ذلك، ضع البيض في حضانة مرطبة عند درجة حرارة 38 degrees Celsius وقم بتفعيل خاصية التدحرج. وبعد انتهاء فترة تحضين البيض، قم بتعقيم الأجزاء العلوية عن طريق رشها بـ 70%ethanol ثم مسحها بسرعة باستخدام منديل Kim wipe. ولتجنب أي امتصاص عبر قشرة البيضة، ضع كل بيضة معقمة على حامل بيض فردي، على غرار طبق Petri المبطن بمناديل Kim wipes مطوية كما هو موضح هنا. ثم باستخدام ملقط AA معقم، اصنع ثقباً صغيراً في السطح العلوي لقشرة البيضة عند الطرف المدبب للبيضة.

قم بتجهيز حقنة سعة خمسة ملي لتر بإبرة تحت الجلد قياس 18.5. ثم أدخل الإبرة عمودياً في الثقب الموجود في قشرة البيضة، مع توجيه الشطب نحو الطرف المدبب للبيضة. ولتجنب إتلاف المح، عن طريق السحب العرضي، قم بتنظيف الثقب بـ 70% ethanol كما سبق، ثم أحكم إغلاق الثقب باستخدام شريط لاصق.

بعد ذلك، وباستخدام ملقط double A، قم بعمل ثقب آخر في السطح العلوي المحدد للساق الأفقية، بحيث لا يكون عند القمة تماماً. تالياً، أدخل أحد طرفي ملقط القزحية المنحني في الثقب بشكل موازٍ للبيضة. ثم قم بالضغط على القشرة مع التحريك في حركة دائرية.

قم بعمل فتحة بقطر 2 cm في قشرة بيضة الدجاج، وتخلص من جزء القشرة الذي تمت إزالته. يجب أن يظهر الجنين كقرص معتم فوق المحّ. تخلص من أي بيض غير مخصب، والذي يمكن التعرف عليه من خلال وجود بقعة بيضاء صغيرة على سطح المحّ أو غياب القرص الجرثومي.

الآن، ومع ارتداء واقي العين المناسب، قم بثني إبرة تحت الجلد عيار 26.5 بزاوية 45 درجة بدءاً من قاعدة الإبرة. بعد تركيب الإبرة المثنية بحيث يكون الجانب المائل للأعلى في حقنة سعة 1 مل، املأ الإبرة بحبر الهند المخفف. اثقب غشاء المح في منطقة خارج محيط الـ blaster، ثم مرر طرف الإبرة أسفل الجنين، بحيث يكون قريباً من سطح المح، ولكن ليس داخل الطبقات الجنينية.

بعد ذلك، احقن كمية كافية فقط من الحبر لتحديد محيط الجنين، مع تجنب حقن أي فقاعات. اسحب الإبرة بعناية. الآن استخدم مجهراً ستيريوسكوپياً ومصدراً ضوئياً ذا حمل حراري محدود، مثل مصباح عنق الإوزة بالألياف الضوئية الموضح هنا.

قم بتحديد مرحلة نمو الأجنة وفقاً لتصنيف هامبورجر وهاملتون. سجل المرحلة على قشور البيض. ثم ضع قطرتين إلى ثلاث قطرات من محلول رينجر المعقم والدافئ على سطح الأجنة لمنع الجفاف والتلوث.

بعد ذلك، قم بمد غشاء البارافيلم فوق سطح البيض لإغلاق النوافذ مؤقتاً. بعد ذلك، قم بتجهيز بيض السمان لعملية النقل. وقبل إخراج البيض من الحاضنة، املأ طبق بتري بمحلول رينجر.

بعد ذلك، افتح البيوض من الجانب غير المدبب باستخدام ملقط منحني لإظهار الجنين. وباستخدام مقص التشريح، قم بإجراء أربعة شقوق على شكل مربع عبر الغشاء الزغبي والقرص المعقيمي خارج الجنين، مع التأكد من التقاء جميع الشقوق. ثم باستخدام ملقط قزحية منحني، امسك أحد حواف الشق برفق وارفع الجنين من البيضة وانقله إلى طبق بتري المجهز.

أخيرًا، قم بإزالة الغشاء المحيقي بلطف باستخدام ملقط رقم خمسة، ثم قم بتحديد مرحلة الأجنة تحت مجهر تشريحي. قم بإزالة البارافلم من جنين الدجاجة المضيف. بعد ذلك، وباستخدام إبرة تنجستن مدببة، اصنع ثقباً صغيراً في الغشاء المحيقي عند المنطقة المطلوبة من الأنبوب العصبي.

أضف قطرة من محلول رينجر إلى الجنين. بعد ذلك، بالنسبة للطعوم أحادية الجانب، كما هو موضح في هذا الفيديو، استخدم إبرة زجاجية مسحوبة لإجراء شقوق عرضية من الجهتين المنقارية والذيلية بدقة في منطقة الدماغ المتوسط للأنبوب العصبي، مع مراعاة عدم تجاوز التجويف. ثم قم بالقص ثنائياً بين الأنبوب العصبي الظهري والميزوديرم الجداري.

أخيرًا، افصل بعناية الجزء المستأصل (ex explan) عن الأنبوب العصبي، ثم قم بإزالته من الجنين عن طريق شفطه في ماصة دقيقة زجاجية. أولاً، استخدم جنيناً لسمانة في نفس المرحلة العمرية. ثم استأصل منطقة من الأنبوب العصبي بحجم مماثل لما تم عرضه للتو، واشفط الجزء المانح (X explan) في ماصة دقيقة زجاجية تحتوي على محلول رينجر (ringers solution).

انقل قطعة الإيضاح X إلى المنطقة المجاورة للمنطقة المستأصلة من مضيف الصوص. ثم باستخدام إبرة زجاجية مسحوبة، وجه قطعة الإيضاح برفق وقم بتوجيهها إلى المنطقة المزال نسيجها. أضف بعناية بضع قطرات من محلول رينجر إلى الجنين لمنع الجفاف.

أخيرًا، قم بإغلاق النافذة باستخدام شريط لاصق، مع التأكد من أن الشريط يغلق المنطقة بأكملها من البيضة التي تحتوي على النافذة، ثم أعد البيضة إلى الحاضنة حتى الوصول إلى المرحلة المطلوبة، مع إيقاف تشغيل وظيفة الهز أثناء تحضين kyira، ويمكن تدوير X بلطف يدويًا مرتين في اليوم لزيادة قابليتها للبقاء. إذا كانت المراحل المتأخرة من النمو هي المستهدفة، فإن هذه الصورة التمثيلية للمنطقة المطعمة من الأنبوب العصبي بعد ست ساعات من إعادة التحضين حتى المرحلة HH 11، تظهر الاندماج المتوقع لأنسجة المانح من السمان المطعمة داخل الأنبوب العصبي للمضيف من الدجاج. يظهر هذا المقطع العرضي عبر المنطقة المطعمة في المرحلة HH 11 خلايا العرف العصبي المحددة بـ hnk، حيث تهاجر إحداها جانبيًا بعيدًا عن الأنبوب العصبي.

يتم تمييز خلايا السمان التي تساهم في تدفق هجرة خلايا العرف العصبي وفي الأنبوب العصبي بوضوح باستخدام QCPN. وفي مراحل لاحقة، يمكن تتبع الخلايا المشتقة من خلايا العرف العصبي للسمان وصولاً إلى نسيجها المستهدف النهائي. وكما يتضح في هذا الشكل، تتوزع الخلايا المُميزة بـ QCPN ضمن عملية الفك العلوي لجنين الدجاج في المرحلة E5. ويمكن دمج الجسم المضاد QCPN بسهولة مع أجسام مضادة أخرى لفحص تمايز خلايا العرف العصبي المشتقة من السمان.

في بيئة المضيف. كما يظهر هنا، تم وسم العصبونات الحسية ثلاثية التوائم المشتقة من خلايا العرف العصبي للسمان باستخدام الأجسام المضادة QCPN و T UJ one. عقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الكيمياء النسيجية المناعية والتهجين الموضعي للإجابة على أسئلة إضافية، مثل ما هي الأنسجة التي تنشأ من خلايا العرف العصبي، وما هي الجينات التي تعبر عنها خلايا العرف العصبي أثناء تمايزها إلى أنسجة مختلفة.