تحليل وبناء هياكل الحمض النووي مع 3DNA

الهدف العام من هذا الإجراء هو إتاحة مجموعة برامج 3D NA للعلماء في المختبرات وغيرهم لاستقصاء التنظيم المكاني لـ DNA وRNA باستخدام أدوات حاسوبية متطورة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحميل البرنامج من منتدى 3D NA وتثبيته على جهاز كمبيوتر محلي. وتتمثل الخطوة الثانية في تحليل بنية ممثلة لـ DNA على مستوى خطوات الأزواج القاعدية المكونة لها.

بعد ذلك، يتم تعديل بنية DNA نفسها على مستوى خطوة الزوج القاعدي، ثم يُعاد بناؤها باستخدام معاملات خطوة الزوج القاعدي المحددة حديثاً. والخطوة التالية هي تحليل مجموعة كبيرة من البنى ذات الصلة. أما الخطوة النهائية فهي محاذاة مجموعة من بنى DNA ذات الصلة على إطار مرجعي مشترك من أجل تصور التشوهات العالمية في تلك البنى.

في النهاية، تُستخدم أدوات 3D NA لفحص كيفية مساهمة خطوات الأزواج القاعدية الفردية، بما في ذلك تلك المرتبطة بالأدوية والبروتينات، في الطي العام لـ DNA، ولتحديد مواقع واتجاهات التشوهات العالمية الكبيرة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أن البرنامج قوي وقابل للتطبيق على نطاق واسع على مجموعة متنوعة من الهياكل التي تحتوي على الأحماض النووية. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية، مثل كيفية تنظيم الجينومات في ثلاثة أبعاد، ونوع التشوه الذي يمكن أن يتخذه DNA.

لبدء تثبيت حزمة البرامج، اتصل بموقع three DA الإلكتروني @xthreed. org وانقر فوق الرابط المؤدي إلى منتدى 3D NA. من داخل المنتدى، اختر رابط التسجيل واتبع التعليمات لإنشاء حساب جديد.

بمجرد تحديد اسم المستخدم وكلمة المرور، قم بتسجيل الدخول إلى المنتدى، ثم اختر رابط التنزيلات في قسم الترحيب، وفي الصفحة الجديدة، اختر 3D NA download. انقر نقراً مزدوجاً فوق ملف tar gz لإنشاء مجلد باسم X 3D NA dash V 2.1، والذي يحتوي على برنامج 3D NA. افتح تطبيق الطرفية (terminal)، والذي يوجد عادةً ضمن الأدوات المساعدة (utilities) في أجهزة Macintosh، وانتقل إلى دليل X 3D NA dash V 2.1.

قم بتشغيل نص الإعداد (setup script) اللازم لعمل 3D NA بشكل صحيح. يمكن العثور على جميع الأوامر المستخدمة في هذا الفيديو في البروتوكول المكتوب. بعد ذلك، قم بنسخ إعدادات التصدير المكونة من سطرين والتي تظهر مطبوعة على الشاشة.

إذا كان المستخدم قد وضع البرنامج في دليل التطبيقات، فيجب أن يظهر السطران كما هو موضح هنا. افتح تطبيق تحرير النصوص الموجود في دليل التطبيقات. من قائمة التنسيق، اختر تحويل إلى نص عادي.

إذا كان ملف BRC موجوداً، افتح الملف كـ نص، ثم قم بتحريره ولصق إعدادات التصدير في نهاية الملف. وفي حال عدم وجود ملف bash RC، قم بلصق إعدادات التصدير في ملف فارغ واحفظه باسم bash RC في الدليل الرئيسي. ولكي تصبح الإعدادات الجديدة متاحة، قم بتشغيل ملف Bash RC المحفوظ حديثاً داخل برنامج الطرفية (terminal).

يوضح هذا الفيديو تحليل بنية نموذجية من الأحماض النووية، وهي الحمض النووي DNA المرتبط ببروتين HBB من بكتيريا Borrelia bergdorf eye. تتمثل الخطوة الأولى في تحليل الأحماض النووية ثلاثي الأبعاد في إنشاء ملف يسرد جميع القواعد المقترنة. ويتم ذلك عن طريق كتابة أمر لتطبيق برنامج Find para على البنية الذرية المخزنة في الملف NP two, MP two pdb.

تتمثل الخطوة التالية في التحليل في تحديد المعلمات الهندسية التي تميز البنية. يأخذ الأمر analyze ملف زوج القواعد كمدخل، ويقوم بإنشاء عدة ملفات مخرجات تظهر في دليل العمل. ويمكن بعد ذلك حساب القيم الهندسية عن طريق كتابة analyze two MP two bps.

تتضمن ملفات المخرجات التي تم إنشاؤها ملفين: mp2out، الذي يحتوي على نظرة عامة على المعاملات المحسوبة، وbpco_step_par، الذي يحتوي على قائمة بمعاملات الجسم الجاسئ. بالإضافة إلى تحليل بنية الحمض النووي، يوفر برنامج 3D NA القدرة على بناء نموذج بنيوي من معاملات الجسم الجاسئ باستخدام أمر rebuild من أجل إنشاء نموذج ذري تقريبي، يتضمن إحداثيات لكل من ذرات العمود الفقري والذرات القاعدية. اكتب الأمر المدرج في النص. يوجه هذا الأمر برنامج 3D NA لإدراج شكل قياسي للعمود الفقري لـ BDNA عند بناء النماذج من معاملات الجسم الجاسئ.

يمكن بعد ذلك بناء نموذج لولبي مزدوج باستخدام معاملات الجسم الصلب الموجودة في بنية H-B-B-D-N-A عن طريق كتابة الأمر المناسب. كما يمكن تحرير ملف "par" الخاص بخطوة bpco لإنشاء بنية معدلة. في هذه الحالة، يتم تعديل زوايا الدوران (roll angles) القصوى المتكونة في الموضعين اللذين يشهدان أكبر قدر من الانحناء.

يتم بعد ذلك بناء البنية باستخدام المجموعة المعدلة من معاملات الخطوة كملف إدخال. ويمكن عرض النموذجين باستخدام برنامج عرض جزيئي قياسي، على عكس تحليل بنية واحدة تحتوي على حمض نووي. سيوضح هذا الجزء من الفيديو كيفية تحليل مجموعة كبيرة من البنيات في مجموعة من الملفات، والتي تبدأ بالأسماء MD_set1.pdb وتنتهي برقم.

تتمثل الخطوة الأولى في التحليل في تحديد القواعد المقترنة من خلال تشغيل برنامج find pair كما سبق، وبما أن المجموعة الكاملة من البنى تشترك في مخطط الاقتران القاعدي نفسه، فيجب تشغيل find pair مرة واحدة على ملف ممثل هنا، وهو الملف الذي ينتهي بـ 1001. يؤدي ذلك إلى إنشاء معلومات الاقتران القاعدي وتخزينها في الملف MD at set one BPS PS. والخطوة التالية هي إيجاد المعلمات الهندسية للمجموعة الكاملة من البنى باستخدام الأمر X 3D ncore ensemble.Analyze. بعد ذلك، يمكن استخراج معلمات الجسم الجاسئ المطلوبة من ملف مخرجات النظرة العامة MD at set one out.

يتم تنفيذ ذلك باستخدام مستخرج مجموعة DCO الثلاثية الخاص بـ Command X. يتم استخراج زوايا التدحرج (roll angles) وإنشاء ملف نصي مفصول بفاصلات يحتوي على هذه الزوايا. ويمكن قراءة هذا الملف بواسطة برامج أخرى لإجراء المزيد من التحليلات والرسم البياني.

تتضمن النسخة الأحدث من برنامج 3D NA ميزة جديدة تتيح للمستخدم معاينة هياكل متعددة من منظور مشترك. يقوم أمر إعادة توجيه مجموعة X three DCO بتراكب مجموعة من الهياكل ذات الصلة على زوج قاعدي مشترك أو خطوة زوج قاعدي، كما هو موضح في البروتوكولات السابقة. تتمثل الخطوة الأولى في حساب الاقتران القاعدي للحمض النووي DNA باستخدام برنامج find pair.

في هذه الحالة، ملف الإدخال هو ملف PDB واحد يحتوي على 10 بنى لـ CIA coli، وهو مشغل O 3D NA المرتبط بالقطعة الرأسية من بروتين LAC Repressor. ستقوم الأداة Command X three DCO ensemble reorient بمحاذاة النماذج الفردية في بنية متعددة النماذج على إطار مرجعي مشترك. تتطلب هذه الأداة كلاً من ملف PDB وملف اقتران القواعد من الخطوة السابقة كمدخلات.

كما يتضمن الأمر هوية خطوة الزوج القاعدي التي تمت محاذاة جميع البنى بالنسبة لها. تشتمل واجهة الويب الخاصة بـ W 3D NA على بعض الميزات الشائعة لحزمة برمجيات 3D NA. يسلط هذا الجزء من الفيديو الضوء على القدرة على إنشاء نماذج ثلاثية الأبعاد للحمض النووي DNA المزين بالبروتين باستخدام خادم الويب.

تتمثل الخطوة الأولى في بناء نموذج DNA مزين بالبروتين في زيارة موقع W 3D NA الموجود على العنوان W three d.rutgers.edu. يؤدي اختيار "reconstruction" من القائمة الموجودة في أعلى يسار الصفحة إلى تفعيل إمكانيات بناء النماذج عبر الإنترنت. الخطوة التالية هي اختيار رابط "bound protein DNA template" الموجود في المربع المظلل قليلاً في منتصف الصفحة الجديدة.

سيؤدي هذا الاختيار إلى تفعيل قائمة منسدلة تتيح للمستخدم تحديد عدد البروتينات المرتبطة. ويؤدي اختيار عدد البروتينات المرتبطة إلى الانتقال لصفحة مواصفات جديدة، حيث يمكن للمستخدم بعد ذلك كتابة التسلسل المطلوب أو لصقه.

يوجد في مربع النص، في منتصف الصفحة الجديدة، قائمة منسدلة أسفل مربع النص لاختيار التشكيل الحلزوني للمناطق غير المرتبطة من DNA. كما يوجد مربع نص بالقرب من أسفل صفحة المواصفات لإدخال مواقع الارتباط وأسماء ملفات البروتينات المرتبطة. ويحدد موقع الارتباط موضع مركز قطعة البروتين المرتبط بتسلسل DNA.

في أسفل صفحة المواصفات، يوجد مربع يسمح للمستخدم بإنشاء معاينة للحمض النووي المرتبط بالبروتين. في هذه الحالة، يتم تحديد هذا المربع والنقر على زر الاستمرار. يؤدي هذا الإجراء إلى إنشاء صفحة مراجعة تسرد المعلمات المختارة، بالإضافة إلى أي أخطاء قد تكون نتجت عن تداخل مواقع الارتباط المختارة.

يمكن للمستخدم تحديد زر الرجوع في حال الحاجة إلى إجراء أي تغييرات، أو زر البناء للمتابعة. وتعرض الصفحة التالية صورة ثابتة لمعقد البروتين والحمض النووي DNA في أكثر ترتيباته امتداداً، وتتيح التصور التفاعلي عبر الإنترنت من خلال الويب. كما يمكن للمستخدم أيضاً تنزيل ملف يحتوي على الإحداثيات الذرية.

تُستخدم أدوات برمجيات 3D NA بشكل روتيني لتحليل تراكيب الأحماض النووية. وتكشف قيم معاملات الجسم الصلب عن تشوهات في التركيب ثلاثي الأبعاد، مثل موقعي الانثناء الشديد للحمض النووي DNA نحو الثلم الرئيسي مع زوايا دوران (roll) موجبة كبيرة وُجدت في الخطوتين 13 و 22، وذلك في المعقد البلوري للحمض النووي DNA مع بروتين Borrelia Bergdorf, RHBB.

إن قدرة البرنامج على إعادة بناء الهياكل من هذه الكميات تجعل من الممكن تحديد كيفية مساهمة كل قاعدة وخطوة زوج قاعدي بشكل فردي في الطي الجزيئي العام. وكما هو موضح هنا، فإن الانحناء الشامل لـ DNA الناجم عن HBB يعكس ما هو أكثر من تشوهات الدور المتطرفة المذكورة أعلاه؛ حيث يظل DNA شديد الانحناء حتى عند إعادة بنائه مع تقويم خطوات الأزواج القاعدية هذه.

يحدث ذلك عندما يتم تعيين أكبر قيمتين للدوران إلى الصفر. وتتيح الإمكانية الجديدة في 3D NA لفحص أعداد كبيرة من الهياكل ذات الصلة استخراج الأنماط المعتمدة على كل من التسلسل والوقت في الترتيبات المكانية لجزيئات DNA و RNA المحاكات. فعلى سبيل المثال، يكشف التلوين الأصفر لزوايا الدوران بين الأزواج القاعدية المتتالية في مجموعتين كبيرتين من هياكل DNA المحاكات عن الانحناء المفضل لهذه الجزيئات عند خطوات الأزواج القاعدية البيورينية.

تشير قيم الدوران (roll) الأعلى الموضحة باللون الأحمر، والتي تستمر لفترات قصيرة عند نهايات الـ DNA، إلى حدوث انصهار موضعي وإعادة تشكل لبنية اللولب المزدوج. ويمكن لأنماط التباين في معلمات الجسم الصلب الأخرى، مثل الزوايا والمسافات بين القواعد المتكاملة، أن تساعد في فك رموز التشوهات الهيكلية الدقيقة. كما تكشف قدرة برنامج 3D NA على إعادة توجيه الجزيئات ذات الصلة في إطار مرجعي مشترك عن سمات في البنية العامة كانت خافية في العديد من الملفات المخزنة في بنك بيانات البروتين (protein data bank).

على سبيل المثال، ينتج عن المحاذاة التقليدية للهياكل ذات الصلة بناءً على متوسط مربع جذر الملاءمة للذرات المتقابلة سلسلة من المسارات المكانية المتشابهة التي تتراكب تقريبًا فوق بعضها البعض هنا، وهي النماذج العشرة القائمة على الرنين المغناطيسي النووي (NMR) لبروتين كابت الـ LAC من بكتيريا Esia coli المرتبط بـ O 3D NA في القطع الرأسية؛ حيث يكشف تراكب الهياكل نفسها على إطار إحداثيات مشترك عند الزوج القاعدي الطرفي 5' لكل مزدوج عن تشوهات كبيرة في الهيكل العام، حيث تنثني الجزيئات في اتجاهات مختلفة بشكل ملحوظ. قد تؤثر هذه التباينية الهيكلية على السهولة التي يرتبط بها بروتين كابت الـ LAC في بكتيريا CIA coli بـ O three ويحفز تكوين حلقة بين O three والمشغلات البعيدة تسلسليًا في مشغل الـ LAC. وكما هو موضح هنا، فإن الوضع الدقيق لبروتين معماري مثل HBB من بكتيريا Borrelia burgdorferi يمكن أن يكون له تأثير كبير على الطي العام للـ DNA.

إذا كانت هناك نسختان من البنية المعروفة عالية الدقة تفصل بينهما 43 زوجاً قاعدياً، فإن قطعة DNA بطول 81 زوجاً قاعدياً تنغلق في تكوين دائري ضيق تقريباً. أما إذا كانت البروتينات تفصل بينها خمسة أزواج قاعدية إضافية، فإن الـ DNA يتبع مساراً متعرجاً مفتوحاً. وتوضح هذه الترتيبات المختلفة تماماً للضفيرة المزينة بالبروتينات كيف يمكن أن يؤثر التباعد بين البروتينات البنائية على حلقنة الـ DNA أو التواؤمه بعد تطوره.

لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا البنيوية للأحماض النووية لاستكشاف تفاعلات البروتين مع DNA، وطي RNA، وتصميم الجسيمات النانوية، وذلك من أجل اكتساب فهم أفضل للعيوب التنموية والأمراض مثل السرطان وتصميم علاجات جديدة.