تصور الردود السم البكتيري المستحثة عن طريق لايف مضان المجهري الخليوي

الهدف من هذا الإجراء هو تصور استجابات الخلايا المناعية للسموم البكتيرية. أولاً، يتم التعبير عن السم وتنقيتها من خلايا BL 21 gold. وبمجرد التأكد من نشاط السم وتركيزه، يتم إيصال السم إلى الخلايا المناعية.

يتم استخدام محقن دقيق ومجهر عالي السرعة للخلايا الحية. ويكشف تحليل الصور الناتجة عن الحركية في الوقت الفعلي لاستجابات الخلايا المناعية تجاه الذيفان. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علم المناعة، مثل آلية تنشيط الجسيم الالتهابي.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول استجابات الخلايا المناعية بوساطة السموم، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على محفزات أخرى بما في ذلك العوامل الجاذبة كيميائياً. لقد تولدت لدينا الفكرة لهذه الطريقة لأول مرة عند دراسة التفاعل بين البكتيريا والخلايا المناعية المستنبتة، حيث لاحظنا تفاعلات متباينة للغاية بين البكتيريا والخلايا المناعية. ابدأ بتنقية strep lysin O أو SLO باستخدام مستنبت من خلايا BL 21 gold التي تحتوي على PAG three SLO.

يُنمى البلازميد الخاص به حتى تصل الكثافة الضوئية (OD) إلى 0.6 تقريبًا. ولتحفيز تعبير البروتين، أضف خمسة ملليلترات من OSes بتركيز 20% إلى المزرعة مع الرج بسرعة 225 RPM في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات. بعد ذلك، انقل البكتيريا إلى زجاجة طرد مركزي سعتها 500 ملليلتر.

بعد ذلك، يتم طرد المزرعة مركزياً بسرعة 12,000 ×g لمدة 12 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C، ثم يتم سكب السائل الطافي بعد عملية الطرد. يتم تخزين الراسب عند درجة حرارة -80 °C طوال الليل أو لفترة أطول إذا لزم الأمر. ولتنقية البروتين SLO المُعبّر عنه، يتم إضافة 10 mL من محلول غسيل ly buffer المضاف إليه Triton X 100 والليزوزيم (lysozyme) وفينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (phenyl methyl sulfuryl fluoride) إلى الراسب المجمد، ثم يتم سحب السائل وإطلاقه بواسطة الماصة (pipette up and down) لمدة 15 دقيقة تقريباً.

لإعادة التعليق، قم بتعليق الراسب مع إبقاء العينة على الثلج. انقل الراسب المعاد تعليقه إلى أنبوب بولي بروبيلين مستدير القاع من شركة Oak Ridge سعة 50 milliliter. قم بتجنيس المستخلص باستخدام جهاز سونيكيت بمسبار (probe sonicator) عند قدرة 40% لخمس مرات، لمدة 30 seconds في كل مرة، بفواصل زمنية قدرها 30 seconds، مع وضع العينة على الثلج لمدة 30 seconds بين كل دورة وأخرى.

بعد ذلك، يتم طرد المستخلص الناتج عن الموجات فوق الصوتية مركزياً عند 39,000 ×g لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. وبعد عملية الطرد المركزي، يُضاف السائل الطافي البكتيري إلى 1 mL من حبيبات النيكل NTA المغسولة. تُحضن حبيبات النيكل NTA مع المستخلص معاً لمدة 2.5 ساعة عند درجة حرارة 4 °C مع الرج الخفيف بعد فترة التحضين.

قم بترسيب الحبيبات عن طريق الطرد المركزي بسرعة 400 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C. لاحظ أن جميع عمليات الغسل والاستخلاص اللاحقة تُجرى باستخدام إعدادات الطرد المركزي هذه ما لم يُذكر خلاف ذلك. بعد عملية الطرد المركزي.

امزج 30 µL من السائل الطافي مع 10 µL من منظم عينات SDS رباعي التركيز في أنبوب طرد مركزي صغير واحفظه على الثلج لتحليل النقاء. ثم تخلص من المتبقي من السائل الطافي واغسل الحبيبات أربع مرات باستخدام منظم غسيل lice، ومرة واحدة باستخدام منظم salt، مع إجراء عملية الطرد المركزي بعد كل غسلة. من هذه النقطة فصاعداً، تأكد من الحفاظ على العينة على الثلج في جميع الأوقات.

يعد بروتين SLO حساساً جداً للأكسدة والاختزال، ويفقد نشاطه بسرعة إذا تم تدفئته إلى 37 درجة مئوية، حتى لو كان ذلك لفترة زمنية قصيرة. ولشطف بروتين SLO، أضف 1 mL من محلول الشطف و 5 µL من DTT بتركيز 1 M إلى الحبيبات، ثم قم بالتحضين على الثلج لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، قم بالطرد المركزي وجمع السائل الطافي في أنبوب طرد مركزي يحمل ملصقاً برقم عملية الشطف.

كرر هذه العملية ثلاث مرات، ثم لإزالة الداخلي السموم (endotoxin) من بروتين SLO، أضف 200 µL من خرزات agro المدمجة والمغسولة (poly mixing conjugated agro beads)، المعلقة في محلول res salt buffer إلى العينة ورجّها عند درجة حرارة 4 °C لمدة 30 دقيقة. ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 10,000 ×g لمدة دقيقة واحدة عند درجة حرارة 4 °C. بعد الطرد المركزي، اجمع السائل الطافي في أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة وموسومة.

اجمع 30 µL من كل شطفة مع 10 µL من منظم عينات SDS بتركيز 4x. ولتحليل SDS page، احفظ محلول SLO على الثلج. حدد تركيزات البروتين والنشاط الحالة، وفي حال كانت النتائج مرضية، اسحب SLOE في كميات تتراوح من 5 إلى 10 µL، ثم جمدها باستخدام الثلج الجاف وخزنها في درجة حرارة -80 °C.

بعد ذلك، يتم تحديد التحلل النوعي. ريس. يتم تعليق الخلايا المراد اختبارها بتركيزين. يتم وضع ست خلايا لكل مليلتر في المنظم RB بتركيز 20 ميكروجرام لكل مليلتر.

يوديد البروبيديوم. هنا يتم اختبار خلايا T 27 A. أضف 100 µL من الخلايا إلى كل بئر من ألواح ذات 96 بئراً بقاع على شكل حرف V في أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة.

قم بإجراء تخفيف تسلسلي لـ SLO حتىما يصل إلى ضعفي التركيز النهائي في المنظم buffer rb. ثم أضف إما 100 µL من السم أو 100 µL من المنظم buffer RB إلى الخلايا واحضنها لمدة خمس دقائق عند 37 °C. تتراوح التركيزات النهائية النموذجية من 2000 units per mL إلى 31.25 units per mL.

قم بتشغيل الخلايا على مقياس التدفق الخلوي وجمع البيانات باستخدام مرشحات لـ fi أو cethrin أو pe. يمثل الإزاحة بمقدار لوغاريتم واحد الخلايا النفوذة عابرًا، بينما تشير الإزاحة بمقدار ثلاثة لوغاريتمات إلى الخلايا الميتة. احسب التحلل النوعي للخلايا بطرح النسبة المئوية للخلايا الميتة في عينة الضبط من العينة التجريبية باستخدام المعادلة الموضحة هنا؛ قبل يوم واحد من التجارب، قم بزراعة البلاعات بتركيز 2×10⁵ على زجاج مغطى بالكولاجين.

أطباق ذات قاع بقطر 35 millimeter. يجب أن يكون المجهر المستخدم لإيصال السم مجهزاً بمنصة مقلوبة، ومنصة ساخنة، ومكعبات مرشحات الإثارة والانبعاث المناسبة، وعدسة برتاند في حال توفرها. إن الجزء الأكثر صعوبة في هذا الإجراء هو إنزال الإبرة إلى الخلايا دون أن تتضرر.

لضمان النجاح، نستخدم عدسة بيرتراند (Bertrand lens)، والتي تُستخدم عادةً للمحاذاة لرؤية الإبرة أثناء تحريكها عبر المستويات البؤرية. يجب توصيل المجهر بحاقن مجهري (micro injector)، وأن يتم التحكم به بواسطة جهاز كمبيوتر بذاكرة كافية لجمع البيانات وتخزينها؛ قم بتشغيل المجهر والحاقن المجهري، واترك المنصة المسخنة وقتاً كافياً لتصل درجة حرارتها إلى 37 degrees Celsius أثناء انتظار تسخين المنصة. قم بوسم الخلايا بالصبغة لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 37 degrees Celsius.

اعتماداً على المقايسة، يمكن إجراء الوسم باستخدام 5 µL من 4 أو 2:00 AM في 1 mL من HBSS، أو 2 µL من calcium am في 1 mL من الوسط الكامل؛ وهنا تم استخدام 4 أو 2. يتم إزالة وسط الخلايا وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS. يتم شفط PBS واستبداله بـ 1 mL من RPMI المدعم بـ 2 mM من كلوريد الكالسيوم.

ثبّت الطبق على المجهر، وقم بضبط تركيز الخلايا باستخدام الحقل المضيء، ثم اضبط التركيز ليكون أعلى من الخلايا بقليل. بعد ذلك، اخلط 1 µL من سم SLO مع 4 µL من DEXTRA 5 55 بتركيز 10 mg/mL و 6 µL من الماء. ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 20,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

يُستخدم الديكستران للتحقق من أن طرف الفيمتو ليس مسدوداً. استخدم أداة تحميل دقيقة لتحميل 2 µL من السم المخفف في طرف الفيمتو من الخلف. ثم قم بتركيب طرف الفيمتو على المحقن الدقيق.

ثم اضبط زاوية الحاقن بحيث تستقر الطرف فوق مركز الخلايا مع ترك مساحة للحركة في جميع الاتجاهات، وامسح إعدادات حد Z السابقة التي تحدد أدنى مستوى يمكن أن يصل إليه طرف الحاقن الدقيق. اضبط الحاقن الدقيق للحقن لمدة 0.5 seconds بضغط 120 PSI مع ضغط عكسي قدره 20 PSI. بعد ذلك، اخفض الطرف حتى يدخل في الوسط.

باستخدام عدسة بيرتراند (Bertrand lens). قم بتوسيط الطرف وتتبع حركته أثناء خفضه للاقتراب من الخلايا. وبمجرد أن يخرج السن عن نطاق التركيز، انتقل مرة أخرى إلى البصريات العادية.

يجب أن يكون ظل الإبرة واضحاً في مجال الرؤية. قم بضبط التركيز فوق الخلايا ثم اخفض الإبرة حتى تصبح في بؤرة التركيز. بعد ذلك، قم بضبط تركيز الخلايا وقرّب الإبرة بعناية لتصبح مجاورة لإحدى الخلايا.

بعد تعيين حد Z للحقن، ابدأ بالتصوير ثم احقن السم. بعد ذلك، ارفع الإبرة وانتقل إلى منطقة جديدة من الخلايا. احقن كمية إضافية من السم وواصل التصوير بعد عملية الحقن.

حرك الإبرة إلى موضع البداية لمنع أي تسرب غير مرغوب فيه للسموم من الإبرة باستخدام الطريقة الموضحة في هذا الفيديو، من 10⁷ إلى 10⁸ وحدة لكل milliliter. يتم الحصول على SLO عادةً بتركيز بروتيني يبلغ 4 mg/mL. يظهر هلام SDS page هذا عينات بكتيرية قبل وبعد تحفيز السم، ثم بعد التنقية، وكل واحدة من عمليات الشطف الثلاث؛ حيث يكشف صبغ Coomassie blue أن عملية تنقية SLO المحفز تمت بنجاح.

يمثل SLO الحزمة عند 69 كيلو دالتون لتحديد كمية السم المطلوبة لتحلل خلايا T 27 A أو D two. عُرِّضت الخلايا لتركيزات مختلفة من SLO لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية بوجود يوديد البروبيديوم وفُحصت عن طريق قياس التدفق الخلوي. وقد حُدِّد التحلل النوعي كما هو موضح هنا.

250 وحدة لكل مليلتر. يؤدي SLO إلى تحلل بنسبة 50% لكل من خلايا T 27 A وD two. وتكون الجرعة شبه التحللية من الذيفان التي تسبب تحللاً بنسبة 10% هي 62.5 وحدة لكل مليلتر.

تعد هذه القيم مهمة لتحديد مستوى نشاط السم المرجعي لتقييم موت الخلايا بعد التعرض للسم. تم تحضين الخلايا الليفية الجلدية البشرية مع الكالسيوم وatherium homodimer باستخدام مجموعة اختبار الخلايا الحية والميتة من شركة life technologies. وعقب التعرض الموضعي للسم البكتيري، anthro lysin O. يظهر الكالسيوم في هذه الصورة باللون الأخضر وatherium bromide في المناطق الحمراء القريبة من الميكروبيوم، مما يوضح موت الخلايا الذي يتميز بفقدان الكالسيوم وامتصاص athe homodimer، بينما لا تظهر المناطق الأبعد عن الطرف أي تلف.

كما يسمح التوصيل الدقيق للذيفان بفحص الأحداث في الوقت الفعلي مثل تدفق الكالسيوم. تم تعريض هذه الخلايا الجذعية البشرية (dcs) المحملة بـ 4:02 AM لـ SLO بمعدل تدفق ثابت مع تصوير حي متزامن يظهر تحولاً من اللون الأخضر إلى الأزرق. ويشير اللون الزائف إلى زيادة في مستويات الكالسيوم في العصارة الخلوية.

يؤدي SLO إلى زيادة سريعة في الكالسيوم السيتوزولي، والتي تنتشر عبر منطقة الطبق بسبب التوصيل الموضعي. ومع ذلك، فإن الخلايا القريبة فقط من طرف المحقن الدقيق هي التي تواجه السم وتتفاعل معه. يوضح هذا كلاً من التفاعل الخلوي الفردي مع السم والمنطقة المحددة مكانياً لتوصيل السم لتحليل الأحداث في البعد zdi.

تم دمج التوصيل الدقيق مع المجهر البؤري ثلاثي الأبعاد عالي السرعة. تظهر هذه المجموعة من الصور الخلايا التغصنية بعد حقن السم. وقد خضعت هذه الخلايا لتحضين مسبق مع anti CD 11 C المقترن بـ PC الموضح باللون الأخضر لوسم الغشاء البلازمي.

كما يتضح هنا، يتم إطلاق الحويصلات الدقيقة بعد إيصال السموم. وكجزء من عملية الإصلاح الخلوي، تتركز جزيئات السموم على البثور الغشائية، التي يتم طرحها للتخلص من السموم. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إتمام الفحص المجهري في غضون 45 دقيقة.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على برودة الذيفان قبل خلطه مع الخلايا واختبار النشاط الحالة للدم. جيد. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس حركية الوقت الفعلي لاستجابات الخلايا المناعية للذيفانات البكتيرية باستخدام مجهر الخلايا الحية.