عالية الإنتاجية ELISA متسلسل للتأكد من صحة العلامات الحيوية من الأمراض الطعم ضد المضيف الحاد

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام مقايسة الممتز المتبادل للإنزيمات المرتبطة (Eliza) التسلسلية عالية الإنتاجية من أجل تحليل أعداد كبيرة من المؤشرات الحيوية الجديدة التي تم اكتشافها عن طريق البروتيوميات بكفاءة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إضافة العينات إلى لوحة مصدرية، والتي تُستخدم لعمل تخفيفات لكل مؤشر حيوي ولتخزين البلازما المستردة بين الاختبارات. بعد ذلك، يتم إجراء مقايسات Eliza لكل بروتين لتحديد تركيزاتها في عينات المرضى.

في نهاية المطاف، يمكن تقييم ارتفاع مستويات البروتين لهذه المؤشرات الحيوية عند بداية الظهور السريري لمرض الطعم ضد المضيف الحاد. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في قدرة المحللات المتتالية على تحليل بروتينات جديدة متعددة قد لا تكون متاحة دائماً في منصات التحليل المتعدد. وتمتد تطبيقات هذه التقنية لتشمل تشخيص مرض الطعم ضد المضيف الحاد.

بما أن المؤشرات الحيوية التي تم التحقق من صحتها من خلال هذه الطريقة تخضع حالياً للبحث من أجل الرعاية السريرية، وبالرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول المضاعفات في عملية زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم بعد الإصابات، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على اكتشاف المؤشرات الحيوية والتحقق من صحتها لأمراض أخرى مثل مضاعفات زراعة الرئة، أو سرطان الرئة، أو أي مرض قد يكون اختبار الدم التشخيصي مفيداً له.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث من المهم تنفيذ الخطوات المتعددة باتساق لضمان قابلية التكرار وتقليل التباين بين الدفعات. في اليوم السابق للتجربة، يتم إجراء طرد مركزي لعينات الأجزاء المقتطعة من البلازما لمدة 10 دقائق عند 15,300 RCF ودرجة حرارة أربع درجات مئوية لفصل التجلطات في القاع والدهون في الأعلى عن البلازما. بعد ذلك، يتم توزيع 150 µL من البلازما غير المخففة من كل عينة على طبق بـ 96 بئراً ذات قاع على شكل حرف V عن طريق الماصة اليدوية وفقاً لمخططات محددة مسبقاً. يتم تغليف الطبق بورق Paraform ووضعه في غرفة حفظ بشرية عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة.

بعد ذلك، وبعد إعادة تشكيل وتخفيف الأجسام المضادة الماصة لـ IL two receptor alpha وعامل النمو البشري، أو HGF، وفقاً لمواصفات الشركة المصنعة، يتم توزيع كميات مقدارها 50 µL من كل جسم مضاد في كل بئر من ألواح 96 بئراً ذات ارتباط عالٍ ونصف بئر مخصصة لكل منهما. ثم تُغلق هذه الألواح باستخدام سدادة الألواح وتُحضن طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. الآن، يتم تخفيف reg three alpha باستخدام محلول الطلاء الخاص بالشركة المصنعة وفقاً لبروتوكول الشركة، ثم توزيع 25 µL من المحلول في كل بئر من لوح 384 بئراً من نوع no maxor.

ثم يتم تخزين هذا الطبق محكم الإغلاق عند درجة حرارة 4 °C أيضًا في اليوم الأول من التجربة. ابدأ بغسل طبق اختبار مستقبل IL 2 ألفا وحجبه باستخدام blotto في محلول TBS. بعد إعادة تشكيل المحلول القياسي، قم بإعداد منحنى قياسي من ثماني نقاط وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.

في اللوحة التالية، يتم نقل 50 µL من البلازما غير المخففة و 50 µL من كل معيار مكررًا من لوحة المصدر إلى لوحة اختبار ELISA. ثم تحضن اللوحة المغلقة في درجة حرارة الغرفة على جهاز تدوير اللوحات مضبوط على 300 RPM. بعد مرور ساعتين، يتم استرجاع البلازما من لوحة اختبار ELISA الخاصة بـ IL-2 receptor alpha وإعادتها إلى لوحة مصدر البلازما غير المخففة.

بعد إكمال مقايسة الممتز المكون من إنزيم (EIA) وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة، اقرأ الكثافة الضوئية لكل بئر باستخدام قارئ الأطباق المضبوط على 450 إلى 570 نانومتر. بالنسبة لمقايسة Reg three alpha Eliza، انقل أولاً 10 µL من البلازما غير المخففة إلى بئر منفصل في طبق المصدر ذو القاع المقوس، ثم أضف 90 µL من محلول التخفيف الموفر من الشركة المصنعة إلى كل بئر لإنشاء طبق مصدر بتخفيف 1 إلى 10. بعد إكمال Reg three alpha Eliza، وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة، أضف محلول الإيقاف إلى طبق الـ 384 بئراً واقرأ الكثافة الضوئية لكل بئر باستخدام قارئ الأطباق المضبوط على 450 إلى 620 نانومتر. بعد إعادة تكوين وتخفيف أجسام capture antibodies الخاصة بـ elephant و tn FFR one وفقاً لمواصفات الشركة المصنعة، قم بطلاء كل بئر من أطباق الـ 96 بئراً ذات الارتباط العالي والنصف بئر ذات الصلة بـ 50 µL من أجسام capture antibodies.

بعد ذلك، يتم تحضين أطباق الاختبار المختومة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة بالنسبة لطبق elephant، وفي درجة حرارة 4 °C بالنسبة لطبق TN FFR. بعد إكمال تحليل IL 2 receptor alpha Eliza، يتم نقل 60 µL من البلازما غير المخففة إلى طبق مصدر جديد. ثم تُضف 60 µL من 1% BSA في PBS إلى كل بئر لإنشاء طبق مصدر بلازما مخفف بنسبة 1:2.

بعد ذلك، يتم غسل وصد لوحة اختبار HGF باستخدام BLOTTO في محلول TBS، ثم يتم تحضير تخفيف المنحنى القياسي المكون من ثماني نقاط. بعد غسل اللوحة وإتمام خطوة الصد، يتم وضع حصص مكررة بحجم 50 µL من البلازما المخففة بنسبة واحد إلى اثنين ومن كل معيار على لوحة اختبار EISA. ثم يتم تحضين اللوحة المختومة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة على جهاز تدوير الأطباق المضبوط على 300 RPM.

في صباح اليوم التالي، استعد البلازما المخففة بنسبة 1:2 من لوحة اختبار HGF Eliza وأعدها إلى لوحة مصدر البلازما المخففة بنسبة 1:2. بعد إتمام مقايسة الممتز المناعي الإنزيمي (EIA)، ووفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة، قم بقراءة الكثافة الضوئية لكل بئر باستخدام قارئ اللوحات المضبوط على 450 إلى 570 nanometers في اليوم الثاني من التجربة. أولاً، انقل 10 µL من البلازما غير المخففة إلى لوحة مصدر جديدة، ثم أضف 190 µL من 1%BSA في PBS لتحضير 200 µL من البلازما المخففة بنسبة 1:20.

ثم بعد إكمال مقايسة إليزا (ELISA)، وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة، قامت بقراءة الكثافة الضوئية باستخدام قارئ الأطباق المضبوط على 450 إلى 570 nanometers. وبالنسبة لمقايسة TN FFR one، قامت إليزا أولاً بإضافة 25 microliters من 1%BSA وPBS إلى طبق المصدر المخفف بنسبة 1:20، مما نتج عنه 125 microliters من البلازما المخففة بنسبة 1:25 لكل بئر. ثم بعد إكمال مقايسة TN FFR one EIA حسب بروتوكول الشركة المصنعة، تم قياس الكثافة الضوئية لكل بئر باستخدام قارئ الأطباق المضبوط على 450 إلى 570 nanometers. أما بالنسبة لـ I-L-H-E-I-A، فقد تم أولاً نقل 60 microliters من البلازما المخففة بنسبة 1:2 إلى طبق مصدر جديد، ثم إضافة 180 microliters من مخفف IL eight إلى كل بئر لتحضير طبق مصدر بلازما مخفف بنسبة 1:6.

بعد ذلك، وبعد إتمام مقايسة ILH ELISA وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة، يتم قياس الكثافة الضوئية لكل بئر باستخدام قارئ أطباق مضبوط على نطاق من 450 إلى 570 nanometers. وأخيراً، وبمجرد الانتهاء من جميع مقايسات ELISA، يُعاد وضع بلازما الدم غير المستخدمة في أنبوب إيبندورف وتُجمد لاستخدامها مستقبلاً. يوضح هذا الرسم البياني الكثافات الضوئية لمنحنى المعايرة لسبعة أطباق ELISA مختلفة تقيس تركيزات reg three alpha المقابلة لـ 1084 مريضاً تم اختبارهم في التقرير الأولي للمؤشرات الحيوية لمرض داء المطعوم ضد المضيف في الجهاز الهضمي لـ reg three alpha؛ حيث يضمن اتساق الكثافات الضوئية بين الأطباق دقة قياسات تركيز البروتين بين التجارب.

تم حساب تركيزات البروتينات في عينات البلازما عن طريق مقارنة الكثافات الضوئية للعينات بالكثافات الضوئية للمنحنى القياسي. ويمكن استخدام منصة مناولة نظيفة تعمل آلياً لزيادة قابلية التكرار بشكل أكبر، مع تقليل حجم البلازما المستخدم من خلال تشغيل أطباق آبار Eliza والنماذج الإبداعية. وأثناء التخطيط لهذا الإجراء، من المهم تشغيل EISs التي تحتوي على بلازما غير مخففة أولاً حتى يمكن استردادها واستخدامها في تجارب لاحقة بعد تطويرها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البروتيوميات لاستكشاف المؤشرات الحيوية المرشحة في أي مرض مستهدف من خلال الاستخدام الشامل لمقايسات Eliza المتسلسلة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية التحقق من صحة مؤشرات حيوية متعددة باستخدام sequential E مع استخدام أحجام صغيرة من البلازما وتقليل الدورات الحرة.