استخدام LysoTracker لكشف موت الخلية المبرمج في الأجنة والخلايا الجذعية الجنينية التفريق

الهدف من الإجراء التالي هو توضيح كيفية صبغ الجسيمات الحالة (lysosomes) في نوعين من العينات، وهي أجنة الفئران والخلايا الجذعية المتمايزة، باستخدام صبغة lyo tracker للكشف عن أنماط موت الخلايا. ولتحضير عينات الأجنة، يتم أولاً عزل الأجنة جراحياً ووضعها في طبق لتحضير الخلايا المتمايزة. وتُستخدم الخلايا الجذعية الجنينية لتكوين أجسام جنينية.

تُزرع هذه الأجسام الجنينية في معلق، ثم تُنمى كطبقة أحادية على شريحة غرفة. يمكن تحضين جميع الأجنة في الطبقة الأحادية باستخدام Lysotracker Red، ثم تُشطف وتُثبت العينات، وبعد ذلك يمكن تصويرها لفحص وقياس نتائج الصبغ التي تظهر Lysotracker. يُعد الصبغ إجراءً بسيطاً يمكن استخدامه لتقييم موت الخلايا المبرمج في الأجنة والخلايا المستزرعة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل تحليل TUNEL في أن صبغة تتبع OT جزيء صغير، مما يسمح بفحص الأنسجة السميكة بسرعة وسهولة. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول أنماط موت الخلايا المبرمج في أجنة الفئران والمزارع المتمايزة، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنواع أخرى من الأنسجة مثل أجنة الدجاج والخلايا الجذعية البالغة المتمايزة. يتم تزويج إناث الفئران الشابة مع ذكر، وفي الصباحات التالية، يتم التحقق من وجود سدادة مهبلية، والتي تشير إلى حدوث التزاوج.

تعتبر الساعة الثانية عشرة ظهراً من اليوم الذي تظهر فيه السدادة المهبلية بمثابة 0.5 يوم. بعد الجماع، وفي اليوم الجنيني المستهدف، يتم القتل الرحيم للأنثى وفقاً للبروتوكولات المعتمدة، ثم يُنقل الرحم إلى طبق بتري بقطر 10 سنتيمتر يحتوي على محلول Hank's BSS وتُغسل أي آثار للدم. يتم فصل الأجنة وإخراجها من الرحم.

قم بإزالة الأغشية الجنينية الزائدة واغسل الأجنة مرة واحدة على الأقل باستخدام محلول Hank's BSS لإزالة الأنسجة والدم الغريبين. حافظ على الأجنة المشرحة مبردة على الثلج أثناء عملية التنظيف. والآخرين.

قم بتحضير خمسة ملليلترات من محلول صبغ الأجنة بـ Liso tracker. هذه الكمية كافية لعملية جمع أجنة واحدة أو عمليتين. اخلط المحلول برفق لتوزيع الصبغة بالتساوي، ثم انقل الأجنة إلى المحلول وقم بتحضينها عند 37 درجة Celsius لمدة 45 دقيقة.

بعد فترة التحضين، اشطف الأجنة برفق في محلول Hank's BSS أربع مرات، لمدة خمس دقائق في كل غسلة. من المهم إجراء عمليات الشطف برفق لتجنب إتلاف الأنسجة. قم بإزالة السائل ببطء مع إيلاء اهتمام دقيق لمواقع الأجنة الرقيقة، والحرص دائماً على ترك جزء من السائل يغطيها.

بعد ذلك، يتم تثبيت الأجنة في 4%para formaldehyde طوال الليل في اليوم التالي. تُشطف الأجنة مرة واحدة في Hank's BSS لمدة 10 دقائق لإزالة المادة المثبتة. الآن يتم تجفيف الأنسجة من خلال سلسلة من الميثانول للتخلص من التلوين الخلفي.

تعمل هذه الخطوة على تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء أثناء التصوير قبل التخزين. وإذا لزم الأمر، يتم جمع عينة نسيجية من كل جنين لإجراء التحليل الجيني. لاحقاً، تُعاد ترطيب العينة النسيجية قبل عملية التنميط الجيني.

افصل الأجنة في أنابيب فردية تحمل ملصقات تطابق عينة النسيج. يمكن الآن تخزين الأجنة المعزولة لفترة غير محدودة في الميثانول عند درجة حرارة -20 °C، مع حمايتها من الضوء.

ابدأ بتحضير الأجسام الجنينية باستخدام طريقة القطرة المعلقة. ومع كثافة بدائية تبلغ 500 خلية لكل قطرة بحجم 20 µL بعد ثلاثة أيام، انقل الأجسام الجنينية إلى مزارع معلقة في أطباق بيتري غير لاصقة بقطر 10 cm. ازرعها لمدة خمسة أيام، مع تغيير الوسط الغذائي كل يومين بعد انقضاء الأيام الخمسة الأولى.

انقل أجسام الأجنة إلى شرائح ذات ثماني غرف مُجلتنة، مع وضع جسم جنين واحد أو اثنين في كل غرفة. ازرع أجسام الأجنة لمدة 10 أيام أخرى. مع تغيير الوسط كل يومين بعد مرور 10 أيام، اسحب الوسط الموجود برفق وأضف 300 µL من محلول صبغ الخلايا Lyo tracker إلى كل غرفة.

كن حريصاً عند سحب الوسط يدوياً باستخدام الماصة عبر وضع طرف الماصة في زاوية الحجرة. وبهذه الطريقة، لن تقوم بإزالة الأجسام التي لا تزال في مرحلة الالتصاق بسطح الزجاج عن طريق الخطأ. وعند إضافة الوسط مرة أخرى، ضع طرف الماصة في زاوية الحجرة وأضف الوسط ببطء شديد.

حضن الغرف عند 37 degrees Celsius لمدة 15 minutes. ثم اشطفها مرتين باستخدام DPBS لمدة five minutes لكل شطفة. الآن قم بتثبيت الخلايا في 4%paraldehyde لمدة 15 minutes في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، قم بإزالة المثبت باستخدام DPBS عبر غسلتين، مدة كل منهما خمس دقائق. ولتثبيت الأجنة، ضعها في شريحة زجاجية ذات تجويف عميق أو في وعاء بتري صغير. ثم قم بتحضير عينات الخلايا للفحص المجهري عن طريق سحب DPBS.

أزل الغرفة من الشريحة واتركها لتجف في الهواء لمدة خمس دقائق تقريبًا. قم بتغطيتها برقائق الألومنيوم لحماية الفلور. ثم أضف وسط تثبيت مائي مثل vector shield with dappy وضع غطاء الشريحة في الأعلى.

الآن تم تثبيت الشريحة وأصبحت جاهزة للتصوير. قم بمعاينة العينات باستخدام مجهر تشريحي أو مجهر مركب مجهز بمرشح ROD أو Domine أو Texas red. عادةً ما يكون التلوين ساطعاً للغاية، لذا فإن التعريضات الضوئية الطويلة ليست ضرورية عادةً في الوضع اليدوي.

التقط صوراً رقمية لجميع العينات تحت نفس ظروف التعريض الضوئي. ولتحليل الصور كمياً، افتحها باستخدام برنامج Adobe Photoshop أو أي برنامج تصوير مماثل. ولتحديد كمية صبغ lyo tracker، اختر القناة الحمراء.

لاحظ عدد البكسلات للصورة بأكملها كما يظهر في وظيفة المدرج التكراري. بعد ذلك، قم بتطبيق عتبة على الصورة بحيث يتم تمثيل الصبغ الأحمر الآن ببكسلات بيضاء. يؤدي ذلك إلى تحويل الصورة إلى اللونين الأبيض والأسود.

اختر مستوى عتبة محددًا واستخدم هذا المستوى لجميع الصور الموجودة في المجموعة. حدد البكسلات البيضاء باستخدام أداة النطاق اللوني (color range tool) واستخدم دالة المدرج التكراري (histogram) للحصول على العدد الإجمالي للبكسلات البيضاء. استخدم القناة الزرقاء لحساب عدد النوى في الحقل.

يمكن أن يكون من المفيد الاحتفاظ بسجل للعدد من خلال تدوين ملاحظات على الصورة، وتسجيل القيم واستخدامها لحساب متوسط مستوى الصبغ لكل خلية. كرر هذا التحليل باستخدام نفس إعداد العتبة لجميع الصور المتبقية. ولأخذ العينات، استُخدم LyO Tracker لصبغ أجنة طافرة من نوع sonic hedgehog.

بما أن متتبع ly O هو جزيء صغير شديد الانتشار، فقد تم صبغ المناطق العميقة داخل جنين كامل في اليوم 10.5 بعد الجماع، حيث لوحظ زيادة كبيرة في موت الخلايا المبرمج أو PCD في الأجنة الطافرة التي تفتقر إلى sonic hedgehog، ولا سيما في مناطق الأطراف والجسور العصبية. تم تصوير براعم الأطراف في عينات كاملة بتكبير أعلى لتقييم النمط العام. كما تم تقطيع أجزاء مفصولة باستخدام الميكروتوم الاهتزازي.

يشير رأس السهم إلى زيادة الصبغ في الطرف القاصي لخلايا sonic hedgehog null في المقاطع التي تم الحصول عليها باستخدام cryostat. استُخدم صبغ tunnel بالتزامن مع OT Tracker في هذه الشرائح، ورغم عدم وجود ارتباط دقيق بنسبة واحد إلى واحد بين lyo tracker وصبغ tunnel، إلا أن المناطق العامة لـ PCD تتداخل بشكل كبير تحت التكبير العالي. يمكن رؤية نقاط صبغت إيجابياً باختبار tunnel، ولكن ليس otra die، ونقاط صبغت فقط بـ lyra die، ونقاط ذات صبغ متداخل. بعد 10 أيام من استزراع جسم الجنين، تمايزت الخلايا إلى مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا العصبية، والخلايا العضلية، والخلايا العضلية القلبية.

في المزرعة الطبيعية للخلايا الجذعية الجنينية المتمايزة، يوجد عدد قليل من الخلايا التي خضعت للموت الخلوي المبرمج، كما تم الكشف عنها باستخدام مقايسات lyo tracker و tunnel. بعد ذلك، عولجت الخلايا ببيروكسيد الهيدروجين لتحفيز موت الخلايا الناتج عن الإجهاد التأكسدي. وقد أدت الجرعة المنخفضة من بيروكسيد الهيدروجين إلى زيادة صبغ كل من lyo tracker و tunnel مقارنة بعدم المعالجة.

على غرار النتائج التي ظهرت في الجنين، قامت كلتا الصبغتين بتمييز خلايا مشتركة وأخرى فريدة. أدت الجرعة العالية من بيروكسيد الهيدروجين إلى انكماش الخلايا وزيادة انتشار إيجابية كل من متتبع OT واختبار tunnel. وللمقارنة، استُخدم التجويع من المصل لتحفيز الالتهام الذاتي بعد ساعة واحدة من التجويع من المصل.

زادت صبغة متتبع OT. ومع ذلك، ظلت إيجابية tunnel عند مستويات طبيعية. وبالتالي، بينما يعتبر reer سهلاً ومفيداً، فمن المهم المتابعة باختبارات إضافية لتحديد ما إذا كانت الصبغة تمثل الموت الخلوي المبرمج أو الالتهام الذاتي بعد قياس كمية العينات.

باستخدام طريقة Photoshop البسيطة الموضحة سابقاً، أكدت النتائج أن زيادة تركيزات بيروكسيد الهيدروجين أدت إلى مستوى أعلى من صبغ lys tracker. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إتمام إجراء الصبغ هذا في أقل من ساعتين إذا تم تنفيذه بشكل صحيح باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل NX in five أو lc three immuno staining من أجل تأكيد نوع موت الخلايا. تذكر أن Trecker green يعمل حالياً على الخلايا الحية فقط، لذا فإن Reca red هو الخيار الأفضل للعينات التي تتطلب تثبيتاً.