تكرارية الأمثل من دوبلكسات DNA لبلورة-DNA من SeqA مجمعات

توضح هذه التجربة بالتفصيل كيفية الحصول على بلورات ذات جودة حيود لبروتين مرتبط بـ DNA يحتوي على تكرار متسلسل لـ GATC مميثل بشكل نصفى. كرر ذلك لتعزيز تكدس بلورات معقد البروتين و DNA. ابدأ بالتصميم العقلاني لطول DNA، والمسافة الفاصلة بين تسلسلات GATC ونهايات DNA، ثم انتقل إلى استخدام oligonucleotides مفردة السلسلة ومكملة لتنقية DNA، ومن ثم إجراء عملية التلدين (anneal) لتكوين مزدوج DNA مميثل بشكل نصفى، ثم اخلط seq A المنقى لتكوين المعقد.

بعد ذلك، ابحث عن الظروف المثلى لنمو بلورات ذات جودة حيودية للمعقد البروتيني DNA من خلال تجارب البلورة باستخدام شاشات المصفوفة المتناثرة التجارية. النتائج الموضحة. استعرض تأثير تغيير طول DNA والتباعد بين تسلسلات GATC والنهايات على جودة الحيود لبلورات CQ A DNA.

الهدف من هذا العمل هو الحصول على بلورات ذات جودة حيود لبروتين CK المرتبط بـ DNA، ولكن يمكن أن يساعد أيضاً في فهم المتغيرات العامة التي يجب مراعاتها عند تصميم مزدوجات DNA لبلورة معقدات بروتين-DNA أخرى؛ حيث سيتم استخدام هذا الإجراء في دراسة Chang, A، وهو زميل دكتوراة من مختبري. تستخدم هذه الدراسة متغيراً من البروتينات التنظيمية لتضاعف DNA، وهو Seek a الذي يشكل ثنائيات مستقرة ويمتلك منطقة رابطة قصيرة بين نطاقي الـ ization والارتباط بـ DNA.

يقيد هذا المتغير ارتباط DNA بالتكرارات الترادفية GATC التي يفصل بينها حصرياً لفة واحدة من DNA؛ أولاً، يتم تحويل خلايا BBL 20 1D three باستخدام البلازميد الذي يشفر DEMETRIC seq A تحت تحكم محفز T seven. يتم صب تفاعل التحويل على أطباق أغار LB التي تحتوي على 100 micrograms per milliliter من الأمبيسيلين وتوضع في الحاضنة البكتيرية طوال الليل. يتم اختيار المستعمرات المختلطة وبدء مزرعة صغيرة الحجم طوال الليل.

في صباح اليوم التالي، يتم تلقيح لتر واحد من المزرعة باستخدام 10 milliliters من اللقاح الذي تم تحضيره طوال الليل. وعندما تصل المزرعة إلى طور النمو اللوغاريتمي (log phase)، يُضاف 2 milliliters من IPTG بتركيز 0.5 molar لتحفيز إنتاج البروتين. يستمر التحضين لمدة ثلاث ساعات في هزاز مداري عند درجة حرارة 37 °C.

ثم يتم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 3,300 G لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، يتم تعليق كتلة الخلايا في محلول التطهير المنظم أ (purification buffer a) عن طريق المعالجة بالموجات فوق الصوتية (sonication)، ثم تصفية الراشح عن طريق الطرد المركزي عند 39,000 times G لمدة 40 دقيقة. الآن قم بتحميل السائل الطافي (S supernatant) على عمود هيبارين تم موازنته باستخدام محلول التطهير المنظم.

لاستخلاص بروتين CK، استخدم تدرجاً خطياً وصولاً إلى 1 molar من كلوريد الصوديوم؛ حيث يتم استخلاص بروتين CK عند تركيز 0.7 molar تقريباً من كلوريد الصوديوم. اسحب الكسور التي تحتوي على CK وقم بتخفيفها لتقليل القوة الأيونية للعينة.

بعد ذلك، يتم تحميل العينة في عمود كروماتوغرافيا التبادل الكاتيوني الذي تمت موازنته بمحلول التنقية المنظم. يتم تطبيق تدرج ملحي خطي لاستخلاص بروتين CK النقي عند تركيز حوالي 0.4 molar من كلوريد الصوديوم. ثم تُجمع الكسور التي تحتوي على CK.

يُركّز المحلول ليصل إلى 3 mg/mL ويُحفظ في وحدة التخزين. صمم المنظم (Buffer) ليكون متوافقاً مع قليلات النيوكليوتيد (oligonucleotides) غير الميثيلية والميثيلية. جهّز عينات تحتوي على 1 µmol من كل شريط مفرد من الـ DNA المجفف بالتجميد في 800 µL من الماء المقطر مرتين والمعقم بجهاز الأوتوكلاف، ثم استخدم جهاز الرج (vortex) واتركها لمدة 15 دقيقة، ثم أضف 800 µL.

أضف محلول تحميل (loading buffer) بتركيز 2x تم تسخينه مسبقاً إلى كل عينة من قليلات النيوكليوتيد (oligonucleotides) التي يتراوح طولها بين 20 و30 نيوكليوتيد، ثم قم بتحضير هلام منزوع الخصائص (denaturing gel) بتركيز 10%. وبمجرد اكتمال البلمرة، قم بإزالة المشط وشطف الآبار جيداً. ثم قم بتجهيز جهاز الفصل بملء الخزانات العلوية والسفلية بمحلول TBE بتركيز 1x.

قم بتشغيل الهلام مسبقاً عند 750 فولت لرفع درجة حرارته إلى 55 درجة Celsius. ثم أوقف التشغيل واشطف الآبار جيداً باستخدام محلول التشغيل المنظم. والآن قم بتسخين قليلات النوكليوتيد عند 90 درجة Celsius لمدة دقيقتين.

قم بالرج الدوامي والطرد المركزي. تُنقل العينات فوراً لتحميل الهلام. يتم تشغيل الهلام عند حوالي 700 volts حتى تهاجر oligonucleotide.

في منتصف هلام بولياكريلاميد بتركيز 10%، يهاجر صبغ ألفا فينول بلو (alpha phenol blue) بالتزامن مع قليلات النوكليوتيد التي يبلغ طولها حوالي 20 قاعدة، بينما يهاجر صبغ زيلين سيل إف إف (xylene syl ff) بالتزامن مع تلك التي يبلغ طولها حوالي 60 قاعدة. قم بتفكيك الهلام من الجهاز وإزالة الفواصل على سطح مستوٍ، ثم ارفع إحدى الصفائح الزجاجية وقم بتغطية الهلام بغلاف بلاستيكي.

بعد ذلك، اقلب الهلام، وأزل اللوح الزجاجي الآخر ثم غطِ الهلام بغلاف بلاستيكي. بعد ذلك، حدد النطاقات باستخدام الأشعة فوق البنفسجية ولوح فلوري خلف الهلام. ولرؤية ظل الـ DNA، استخدم شفرة حلاقة لاستئصال النطاق وتقطيعه إلى قطع صغيرة.

انقل كل عينة إلى أنبوب معقم سعة 15 milliliter. أضف تسعة milliliters من محلول الاستخلاص (elucian buffer) وقم بالتخفيف طوال الليل عند درجة حرارة 37 degrees Celsius مع الرج. انقل المحلول بعناية إلى أنبوب طرد مركزي قابل للتعقيم باستخدام طرف ماصة مخصص لتحميل الهلام (gel loading pipette tip).

لتجنب نقل قطع الأكريلاميد، أضف 1 mL من خلات الصوديوم بتركيز 3 mM وبدرجة pH 7، بالإضافة إلى 25 mL من الإيثانول 100% المبرد، ثم حضّن المزيج عند درجة حرارة -20 °C لمدة ثلاث ساعات على الأقل. قم بطرد الحمض النووي (DNA) المترسب مركزياً، ثم جفف الرواسب باستخدام جهاز SpeedVac على حرارة متوسطة. أعد تعليق كل راسب في 400 µL من الماء المقطر مرتين والمعقم بجهاز الأوتوكلاف، وانقله إلى أنبوب جديد.

أضف 40 µL من خلات الصوديوم بتركيز 3 M وعند pH 7، و 1 mL من الإيثانول بتركيز 100%، ثم قم بالرج بجهاز vortex والتحضين لمدة 30 دقيقة عند -20 °C. بعد الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 18,000 ×g، اشطف رواسب DNA باستخدام 100 µL من الإيثانول البارد بتركيز 70% لإزالة أي أملاح متبقية، ثم قم بالتدوير لمدة ست دقائق عند 18,000 ×g. بعد ذلك، تخلص من الإيثانول وجفف الرواسب باستخدام جهاز speed vac.

الآن، قم بإعادة تعليق كل كُريّة في 100 µL من الماء المقطر مرتين والمعقم بجهاز الأوتوكلاف. حدد تركيز قليلات النيوكليوتيد باستخدام القياس الطيفي. لتحضير ازدواجيات DNA نصف الميثيلية، اخلط أولاً تركيزات مولية متساوية من السلاسل المفردة المتكاملة.

ثم يتم تسخين المخاليط إلى 95 °C في حمام مائي لمدة خمس دقائق لفك روابط السلاسل. تُترك العينات لتبرد ببطء حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة داخل الحمام المائي. اخلط أحجاماً متساوية من بروتين CQ المنقى بتركيز 81 µM وحمض DNA ميثيلي جزئياً بتركيز 81 µM.

ثم تُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. تُخزن عند درجة حرارة 4 °C حتى الاستخدام، ويتم فحص ظروف التبلور باستخدام شاشات المصفوفة المتفرقة التجارية. وبمجرد تحديد المسارات الأولية للتبلور، يتم تحسين الظروف لتنمية بلورات ذات جودة تسمح بالحيود، ثم تُحمى بلورات CK DNA الناتجة من التجمد.

إما زيادة كمية PEG 400 الموجودة في محلول البلورة ليصل التركيز النهائي إلى 25% أو إضافة 20% glycerol إلى محلول البلورة. استخرج البلورات الفردية باستخدام حلقة نايلون (nylon loop flash). جمد العينات في النيتروجين السائل.

اختبر الآن حد الحيود لكل بلورة عند 100 k. وللحصول على البنية البلورية للطفرة المختصرة من CK المرتبطة بـ Hemi methylated DNA، قمنا بتحسين ثلاثة معاملات بالتتابع على DNA، وهي المسافة بين تتابعات GATC ذات الـ Hemi methylated، وطول الضفيرة، وغياب أو وجود نهايات بارزة في الطرف '5. تستخدم هذه الدراسة متغير DME من seek a مع طفرة نقطية في النطاق الطرفي النهائي تمنع المزيد من الـ ligamentization ورابط مختصر يقيد ارتباط DNA بالترادف.

تشير مقايسات إزاحة الحركة الكهربائية للحمض النووي DNA إلى أن تكرارات GATC التي يفصل بينها دورة واحدة فقط تُظهر أن بروتين CK المعدل يرتبط تفضيلياً بتكرارات GATC التي يفصل بينها من 9 إلى 10 أزواج قاعدية. وبناءً على ذلك، تستخدم عمليات الفحص الأولية مزدوجات يتراوح طولها من 23 إلى 24 زوجاً قاعدياً تحتوي على تكرارين من GATC مُمثيلة نصفياً، ويفصل بينهما إما 9 أو 10 أزواج قاعدية.

أنتجت ثلاث مجموعات من الضفائر المزدوجة بلورات ذات أشكال جيدة. ومع أن أياً من هذه البلورات لم يظهر حيوداً بدقة عالية، إلا أن البيانات أشارت إلى أن فصل تسلسل A-G-A-T-C بمقدار تسعة أزواج قاعدية كان مفضلاً للتبلور، وبشكل غير متوقع، فإن تعزيز تفاعلات العمود الفقري للأخدود عن طريق إدراج ثنائي نوكليوتيد CG بين موقعي GATC لم يغير حد الحيود للبلورات.

على النقيض من ذلك، أدى تحسين طول البروزات (overhangs) إلى تغيير نقاط التلامس الجزيئية ومورفولوجيا البلورة بشكل كبير. وقد أكد التركيب البلوري لبروتين CK هذا المرتبط بمزدوج DNA ميثيلي جزئياً أن الوجه الحر لمزدوج DNA لا يشارك في تلامسات بلورية على الرغم من الحجم النسبي للبروتين وDNA، حيث يتم التوسط في معظم التفاعلات بين الأزواج المتماثلة عن طريق تفاعلات بروتين-بروتين وتفاعلات بروتين-DNA. ومن المثير للاهتمام، في هذه الحالة تحديداً، أن التأثير المفيد لبروز ثنائي النوكليوتيد في الطرف 5' لا يعود إلى تكوين DNA مستمر كاذب (pseudo continuous DNA).

بدلاً من ذلك، يبرز الطرف الخماسي (5') للسلسلة الميثيلية بعيداً عن محاور DNA ويتفاعل مع جزيء CK القريب في المعقد، مما يفسر سبب الحاجة الصارمة إلى نيوكليوتيدين لتغيير التعبئة البلورية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية البروتينات وتصميم مزدوجات DNA لبلورة معقدات البروتين وDNA. ومن المهم تذكر أنه على الرغم من أن هذا البروتوكول صُمم لبلورة معقد CK DNA، إلا أن التحسين العقلاني لطول DNA وتسلسله وأطرافه يوفر إطاراً عاماً لتصميم مزدوجات DNA لبلورة معقدات البروتين وDNA الأخرى.