الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل حويصلات F1 F zero APAs من دماغ الجرذ لإجراء تسجيلات تثبيت الرقعة (patch clamp). ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة الدماغ من الجرذ ثم تجنيسه. وتتمثل الخطوة الثانية في تفكيك المناطق التشابكية عن طريق تسليط الضغط.

بعد ذلك، يتم وضع السينابتوسومات في طبقات فوق تدرجات القوارير. وتتمثل الخطوة النهائية في التحضين مع digitonin و L للحصول على الحويصلات النهائية لتسجيل تثبيت الرقعة. وتعد عملية إنتاج TP عن طريق الفسفرة التأكسدية وظيفة مهمة للميتوكوندريا.

الإنزيم المسؤول عن إنتاج الـ ATP هو إنزيم ATP synthase الموجود في الغشاء الميتوكوندري الداخلي. ولدراسة وظيفة ATP synthase بالتفصيل، نقوم بعزل حويصلات ميتوكوندرية فرعية خاصة نطلق عليها اسم SMVs، وهي تحتوي على إنزيم ATP synthase في تكوين معكوس (inside out).

ثم نقوم بتسجيل هذه الـ SMVs باستخدام قطب تثبيت الجهد (patch clamp electrode)، ونحدد مدى نفاذية غشائها. وهذا يخبرنا عن كفاءة إنتاج الـ TP بواسطة الميتوكوندريا. التي ستقوم بتوضيح هذا الإجراء اليوم هي سيلفيا تي، زميلة ما بعد الدكتوراه في مختبري بجامعة ييل.

في هذا الإجراء، بعد الحصول على رأس الجرذ عن طريق فصل الرأس، يتم قص الجلد لكشف الجمجمة، ثم فتح الجمجمة برفق عن طريق قصها باستخدام مقص أو قصاصة Rons. بعد ذلك، يتم استخراج الدماغ، ثم فرم الدماغ بدون المخيخ، وفي النهاية عزله في محلول منظم، ثم نقله إلى مجانس زجاجي من التيفلون سعة 5 mL، حيث يتم تجنيس النسيج برفق 10 مرات، لمدة خمس دقائق تقريباً في المجمل. بعد ذلك، يتم طرد العينة مركزياً بسرعة 1,500 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C باستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي.

احفظ السائل الطافي الذي يحتوي على الميتوكوندريا والجسيمات المشبكية وتخلص من الراسب. بعد ذلك، قم بطرد مركزه مرة أخرى بسرعة 16,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C باستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي. ثم تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 500 µL من محلول عزل منظم، وقم بتفكيك الجسيمات المشبكية باستخدام وعاء تفكيك الخلايا عن طريق تطبيق ضغط قدره 1,200 PSI لمدة 10 دقائق، يليه تخفيف سريع للضغط. ضع الجسيمات المشبكية المفككة فوق أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على تركيزين مختلفين من fial واللذين سيشكلان طبقتين.

بعد ذلك، ضع الأنابيب في دوار من طراز SW 50.1 وقم بالطرد المركزي عند 126,500 ×g لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. وفي جهاز الطرد المركزي الفائق، تكون الراسبة هي الميتوكوندريا المنقاة. أما الطبقة الموجودة بين الكثافات المختلفة في الأنبوب فهي السينابتوزومات غير المتفككة.

بعد ذلك، يتم غسل الراسب عن طريق الطرد المركزي في محلول عازل للعزل عند 16,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية في جهاز طرد مركزي مكتبي. الآن، أعد تعليق الميتوكوندريا في 200 µL من محلول عازل للعزل، مضافاً إليه حجم مساوٍ من digitonin بنسبة 1%.

ضعها على الثلج لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، أضف المزيد من منظم العزل (isolation buffer) وقم بالطرد المركزي بسرعة 16,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. كرر هذه العملية مرتين، ثم أعد تعليق الراسب في 200 µL من منظم العزل، وأضف 2 µL من مزيج Lybra PX بتركيز 10%، ثم ضعها على الثلج لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك، يتم وضع الخليط في طبقات من منظم العزل (buffer) في أنابيب الطرد المركزي. توضع الأنابيب في دوار SSW 50.1 ويتم إجراء الطرد المركزي عند 182,000 ×g عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعة واحدة. بعد مرور ساعة.

اغسل الراسب النهائي عن طريق طرده مركزياً في محلول عازل عند 16,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. تشتمل منصة الفيزيولوجيا الكهربائية النموذجية على مضخم، وجهاز كمبيوتر شخصي مجهز بـ digi data 1, 440، وواجهة محول من تماثلي إلى رقمي بالتزامن مع برنامج P clamp, 10.0، وأجهزة تحكم دقيقة، ومجهر، وطاولة عزل للاهتزازات، وقفص فاراداي. أولاً، اسحب ماصة من أنبوب شعري من زجاج البوروسيليكات باستخدام ساحبة ماصات دقيقة تعمل باللهب.

يجب أن تتراوح المقاومة المثالية للماصة بين 80 و100 mega ohm. أضف الحويصلات دون الميتوكوندريا في محلول داخل خلوي فسيولوجي. ثم املأ ماصة تثبيت الرقعة (patch clamp pipette) بنفس المحلول.

قم بمعاينة الحويصلات تحت مجهر تباين الطور بعد تثبيت الحويصلات الغشائية الصغيرة (SMVs) في درجة حرارة الغرفة. سجل النشاط عند الحفاظ على الجهد الغشائي عند جهد يتراوح من -100 millivolts إلى +100 millivolts لمدة 10 seconds لكل فترة.

تتم تصفية البيانات المسجلة عند تردد 5 kHz باستخدام دوائر المضخم ويتم تحليلها بواسطة برنامج clamp fit 10.0. يوضح هذا الشكل لطخة من المستخلص المحضر من السيتوزول والميتوكوندريا. ويظهر اللوح العلوي لطخة مناعية باستخدام جسم مضاد ضد البروتين السيتوزولي GA dh.

تظهر اللوحة السفلية لطخة مناعية باستخدام جسم مضاد ضد بروتين الغشاء الداخلي للميتوكوندريا Cox four. وهنا يوجد تسجيلان ممثلان لتقنية تثبيت الرقعة (patch clamp) قبل وبعد إضافة 1 mM من ATP. جهد التثبيت هو 70 mV. يمثل الخط المتقطع 0 pA.

يتم تسجيل كل أثر لمدة 10 ثوانٍ، مع وجود فاصل زمني قدره 10 ثوانٍ بين الآثار المعروضة. تظهر هنا آثار نموذجية لتغيرات شدة فلورة مؤشر CMA بمرور الوقت في وجود SMVs، وفي حالة الغياب والحضور لـ TP. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الميتوكوندريا، والحويصلات تحت الميتوكوندريا التي تحتوي على F1 FO 80 TP Synthes. علاوة على ذلك، يجب أن تفهم كيفية تشكيل ختم مقاوم لـ I باستخدام قطب كهربائي على غشاء الحويصلة لتحليل نشاط القناة لمجمع A TP Syntase.