دراسة كمية تحرك بحرية من حوض الكائنات الحية الدقيقة باستخدام حيود الليزر

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس ترددات التخبط للكائنات المجهرية التي تسبح بحرية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير عينة من الديدان المجهرية، ثم يتم تجهيز الإعداد البصري.

ثم يتم تسجيل نمط الحيود الناتج عن الكائنات الحية. وأخيراً، تُحلل البيانات المسجلة لتحديد ترددات السباحة. وفي النهاية، يُستخدم تحليل الحيود لإظهار التغيرات في أنماط الحركة للديدان غير المقيدة.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل المجهر التقليدي، في إمكانية ملاحظة أنماط السباحة بينما يتحرك النوع بحرية في فضاء ثلاثي الأبعاد. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول السباحة الحرة لـ C. elegans، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على كائنات مجهرية صغيرة وشفافة أخرى معرضة لظروف متنوعة. لإعداد C. elegans للتحليل بالفيديو، ابدأ باستخدام ملقط من سلك البلاتين المسطح لنقل 10 إلى 20 من الديدورات الخيطية البالغة من نوع GR إلى وسط NGM جديد.

أطباق بتري مملوءة بوسط الآجار وتحتوي على بقع دائرية صغيرة من بكتيريا e coli. تُترك الديدان الخيطية لوضع البيض لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس ساعات، ثم تُزال الديدان البالغة. وبذلك يتم إنشاء مستنبت صغير متزامن نموياً يتكون من 50 إلى 150 دودة خيطية؛ ولتنمية هذه الديدان حتى مرحلة البلوغ المبكر، تُحضن أطباق بتري عند درجة حرارة 20 degrees Celsius لمدة تتراوح من أربعة إلى خمسة أيام.

في يوم تحليل الفيديو، استخدم 1 mL من الماء المقطر منزوع الأيونات لشطف طبق من الديدورات الخيطية البالغة اليافعة، وبذلك يتم جمع 50 إلى 150 دودة من المزرعة المتزامنة. استخدم جهاز طرد مركزي دقيق لترسيب الديدان في قاع الأنبوب أو اتركها تترسب بفعل الجاذبية لمدة 15 دقيقة تقريباً. قم بإزالة معظم الماء من الأنبوب واستبدله بـ 1 mL من الماء المقطر منزوع الأيونات لغسل أي بكتيريا ملتصقة بالديدورات الخيطية.

باستخدام ماصة دقيقة، انقل من خمس إلى 10 من الديدان الخيطية (nematodes) في الماء إلى أنبوبة كوارتز. قم بتجميع الإعداد البصري كما هو موضح هنا، باستخدام ليزر هيليوم-نيون بطول موجي 543 nanometer، ومرآتين من الألومنيوم ذات سطح أمامي لتوجيه شعاع الليزر عبر الأنبوبة، وحامل أنبوبة، وشاشة عرض، وكاميرا عالية السرعة قادرة على التصوير بمعدل 240 إطاراً في الثانية تقريباً. بعد ذلك، استخدم قطعة من البارافيلم لتغطية الجزء العلوي من الأنبوبة ثم اقلبها لخلط الديدان الخيطية في عمود الماء.

ضع الـ vete في حامل vete بحيث تكون الديدان في البداية بالقرب من الجزء العلوي من الـ vete. وباستخدام المرايا، وجه شعاع الليزر عبر مركز الـ vete. نظرًا لأن النيماتودا أكثر كثافة من الماء، فإنها ستسقط ببطء إلى قاع الـ vete أثناء السباحة داخل عمود الماء؛ وعلى شاشة العرض، قم بتلوين البقعة المقابلة لشعاع الليزر النافذ باللون الأسود لتقليل التشتت عندما يلتقي الشعاع النافذ بشاشة العرض.

سيؤدي التخلص من التشتت الناتج عن الشعاع النافذ أو تقليله إلى منع تشبع مصفوفة CCD في الكاميرا بسبب هذا الشعاع. ولتحديد مقياس لحجم نمط الحيود، ارسم خطاً بطول خمسة سنتيمترات تقريباً على شاشة الإسقاط بجانب بقعة شعاع الليزر النافذ دون التداخل مع صورة الضوء المحيد. أطفئ إضاءة الغرفة وقم بتسجيل صور الحيود على الشاشة أثناء مرور الديدان عبر شعاع الليزر.

لتجهيز بيانات الفيديو، قم بتثبيت برنامج تحليل الفيديو التالي واستيراد الفيديو إلى البرنامج. حدد نقطة الأصل بحيث تتطابق مع بقعة الليزر المرسلة باستخدام البرنامج. تتبع الإزاحة الزاوية لصورة الحيود التي تشكلها كل نيماتودا.

قم بنسخ البيانات ولصقها في جدول بيانات وأضف 180 درجة أو PI لجميع الزوايا السالبة، وذلك لإنتاج رسم بياني مستمر. وباستخدام إعداد تحليل الفيديو، ضع صماماً ثنائياً ضوئياً (photo diode) بمساحة صغيرة بعيداً عن المركز في نمط الحيود أمام شاشة العرض مباشرةً عبر منفذ USB.

قم بتوصيل الثنائي الضوئي (photo diode) بجهاز راسم الإشارات الرقمي (digital oscilloscope) المتصل بجهاز الكمبيوتر. راقب أنماط التخبط الظاهرة على شاشة الكمبيوتر. احفظ مجموعات البيانات بتنسيق ASCI أو بتنسيق نصي لتحليل البيانات.

استخدم الفيديو أو الصورة لاستيراد البيانات إلى برنامج تحليل بيانات قادر على مواءمة الأشكال الموجية. وباستخدام تقليل مربع كاي (chi-square minimization)، قم بمواءمة منحنى جيبي لتحديد تردد التخبط. قم بحساب متوسط ترددات السباحة من العينات المختلفة، ثم حدد التباين.

لأغراض هذه الدراسة، تم تحليل البيانات إحصائياً باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (single factor ANOVA)، متبوعاً باختبار بونفروني (Bonferroni) للمقارنات المتعددة. وتعتبر قيمة P التي تقل عن 0.05 ذات دلالة إحصائية لنمذجة أنماط الحيود. ابدأ باستخدام المجهر لالتقاط الصور من أجل تحليل الصورة.

قم بسحبه إلى برنامج Mathematica. استخدم الأمر binary eyes لتحويله إلى اللونين الأبيض والأسود. بدلاً من ذلك، استخدم الأمر edge detect لإنشاء صورة باللونين الأبيض والأسود، حيث يتحكم الرقمان الأخيران في درجة خشونة الحواف الناتجة.

بعد ذلك، وباستخدام أمر image data، قم بتحويل الصورة إلى مصفوفة من الأصفار والآحاد. استخدم أمر forer للقيام بعملية forer وتحويل المصفوفة، ثم قم بتربيع القيمة المطلقة للمصفوفة، وعاين الصورة الناتجة، والتي تمثل نمط الحيود المقابل للصورة الأصلية. بالإضافة إلى ذلك، استخدم دالة log لضبط تباين الصورة.

أخيراً، قارن أنماط الحيود النموذجية بأنماط الحيود التي تم الحصول عليها من الديدان التي تسبح بحرية. في هذا المثال، تمت دراسة ديدان *C. elegans* في وعاء كوارتز Q، بعرض 1 cm، وسُمك 5 mm، وارتفاع 4 cm. يتم أخذ عينة من دودة واحدة باستخدام تحليل الفيديو.

بلغ متوسط تردد السباحة الذي تم الحصول عليه من تحليل الفيديو في وعاء بسُمك خمسة مليمترات حوالي 2.5 hertz. وبالمثل، أدى أخذ عينات من دودة واحدة باستخدام طريقة الحصول على البيانات في الوقت الفعلي وجهاز أوسيلوسكوب رقمي إلى تردد سباحة يبلغ حوالي 2.7 hertz. ويمكن تكرار هذا الإجراء للعديد من الديدان.

كشفت دراسة تفصيلية للديدان التي تسبح بحرية عن متوسط تردد سباحة يبلغ 2.37 hertz في وعاء vete بسعة خمسة مليمتر. وكما هو متوقع، فإن تردد السباحة أعلى منه في حالة الدودة التي تزحف. وباستخدام طريقة الحيود هذه، وُجد أن متوسط ترددات السباحة لـ sea elegance، المحصورة في شريحة مجهرية، يتطابق مع القيمة المنشورة سابقاً وهي two hertz.

اتباعاً للفيديو؛ تتيح عملية تحضير البيانات ونمذجة أنماط الحيود الموضحة في هذا الفيديو نمذجة أنماط حيود السباحة. وبمساعدة صور الديدان التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر تقليدي، تُستخدم أنماط الحيود المنمذجة لمحاكاة دورة سباحة دودة sea elegance.

يتكون النموذج الناجح من أنماط سباحة قابلة للتطبيق فيزيائياً، وتتطابق مع ترددات السباحة. يجب أن يكون الدود في نفس الشكل عند نهاية دورة السباحة كما كان في بدايتها. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في أقل من دقيقة لكل دودة باستخدام النظام الغذائي الضوئي السريع مع مراقبة دورات السباحة على شاشة الكمبيوتر.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم الديدان الخيطية التي تسبح بحرية.